Μελέτη των μεταβολών των IFN-γ και IL-4 στα λεμφοκύτταρα του περιφερικού αίματος σε σκύλους με ασυμπτωματική και συμπτωματική λεϊσμανίωση (Leishmania infanium, syn. chagasi), καθώς και πριν και μετά την αντιλεϊσμανική θεραπεία με μιλτεφοσίνη και αλλοπουρινόλη

Abstract

Canine leishmaniosis (CanL), caused by the intracellular protozoan parasite Leishmania infantum, is a systemic disease with zoonotic potential and a high prevalence among the canine population of the Mediterranean countries. Clinical manifestation can range from self- healing cutaneous lesions to fatal disseminated visceral disease. The sophisticated and delicate interaction between the cellular and humoral immune system of the canine host, will dictate the resistance or susceptibility to the infection as well as the progression and outcome of the disease when is finally established. In this study, we investigated the changes of IL-4 and IFN-γ expression of CD4+ and CD8+ lymphocytes in the peripheral blood of naturally infected dogs, using flow cytometry and taking into consideration their clinical status and the effect of the antileishmanial treatment, as selected criteria. For the design of this, cross-sectional, blind and controlled study, a total of 40 leishmanial dogs were allocated into to two groups. Twenty breed, sex, age-matced and clinically healthy dogs, that had been tested negative for L. infantum with IFA serology and PCR, served as controls (group M). Group L1 included 20 asymptomatic, but IFA and PCR positive for Leishmania dogs, belonging to various breeds and ranging in age from 1 to 7 years, and group L2 20 symptomatic dogs which were breed, sex and age matched and had a history, clinical picture and clinicopathological profile typical of CanL. The diagnosis of the disease was confirmed by lymph node cytology coupled with a positive IFA and PCR result. Finally, Group L3 contained 5 dogs, selected randomly from group L2 and treated with oral miltefosin and allopourinol for 30 days. The T-lymphocytic subpopulations flow cytometry results revealed an increased percentage of CD4+ T-lymphocytes in the clinically healthy (Group M) and the asymptomatic dogs (Group L1) in comparison to the symptomatic ones (Group L2), in which the CD8+ subpopulation was increased whereas the CD4+ one decreased. The CD4+/CD8+ ratio was partly restored after a 30-day antileishmanial therapy with oral miltefosin and allopourinol. The expression of IFN-γ was high in both lymphocytic subpopulations of the symptomatic dogs (Group L2), regardless of the type of the in vitro immunostimulation applied (PMA/iono or LSA). In contrast, IL-4 was hardly detected in both control (Group M) and asymptomatic dogs (Group L1), despite the non specific (PMA/iono) or specific (LSA) immunostimulation. Finally, the expression of IL-4 was increased in CD4+ and CD8+ lymphocytic subpopulations of symptomatic dogs (Group L2), especially with the help of specific immunostimulation (LSA).

Στη λεϊσμανίωση του σκύλου, οι υπεύθυνοι ανοσοπαθογεννητικοί μηχανισμοί για την ανθεκτικότητα ή την ευαισθησία των μολυσμένων σκύλων και την εξέλιξη της προκαλούμενης νόσου παραμένουν αδιευκρίνιστοι σε αρκετά σημεία. Από τους περισσότερους ερευνητές υποστηρίζεται ότι η ενεργοποίηση των CD4+Th1 λεμφοκυττάρων εμποδίζει το μολυσμένο ζώο να εξελιχθεί σε συμπτωματικό, ενώ όταν ενεργοποιηθούν τα CD4+Th2, το παράσιτο διασπείρεται στους διάφορους ιστούς και εκδηλώνονται τα ανάλογα συμπτώματα. Στην συγκριτική αυτή μελέτη, επιχειρήθηκε η εκτίμηση της ανοσοαπάντησης των λεϊσμανιακών σκύλων στο υπεύθυνο παράσιτο, μέσω της παραγωγής των ενδοκυττάριων κυτταροκινών IFN-γ και IL-4 από τους λεμφοκυτταρικούς υποπληθυσμούς CD4+ και CD8+, που ενεργοποιούν την κυτταρική και χυμική ανοσία, αντίστοιχα. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε η κυτταρομετρία ροής σε δείγματα περιφερικού αίματος. Η μελέτη αυτή, που ήταν στιγμιαία, τυφλή και με μάρτυρες, περιελάμβανε 4 ομάδες ζώων. Συνολικά χρησιμοποιήθηκαν 60 σκύλοι από τους οποίους οι 40 ήταν μολυσμένοι με τη L.infantum, ενώ οι 20 ήταν κλινικά υγιείς και αρνητικοί και χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες (ομάδα Μ). Οι μολυσμένοι σκύλοι χωρίστηκαν στην ομάδα Λ1, που περιελάμβανε 20 ασυμπτωματικά αλλά θετικά στη L.infantum ζώα, τόσο ορολογικά (IFA) όσο και μοριακά (PCR) και την ομάδα Λ2, που περιελάμβανε 20 συμπτωματικά ζώα στα οποία η νόσος επιβεβαιώθηκε παρασιτολογικά, ορολογικά και μοριακά. Τέλος, η ομάδα Λ3 αποτελούνταν από 5 άρρωστα ζώα της ομάδας Λ2 που υποβλήθηκαν σε αντιλεϊσμανιακή θεραπεία από το στόμα με το συνδυασμό μιλτεφοσίνης και αλλοπουρινόλης για τριάντα ημέρες. Η κυτταρομετρία ροής έδειξε ότι στους κλινικά υγιείς και τους ασυμπτωματικούς σκύλους το ποσοστό των CD4+, ήταν αυξημένο σε σύγκριση με τους συμπτωματικούς στους οποίους τα CD8+ ήταν αυξημένα και τα CD4+ μειωμένα. Επίσης ο λόγος CD4+/CD8+ ήταν μειωμένος στους συμπτωματικούς σε σύγκριση με τους ασυμπτωματικούς και τους σκύλους μάρτυρες. Η σχέση αυτή αποκαταστάθηκε μερικώς μετά το τέλος της αντιλεϊσμανιακής θεραπείας (ομάδα Ομάδα Λ3). Η έκφραση της IFN-γ αυξήθηκε σημαντικά στoυς λεμφοκυτταρικούς υποπληθυσμούς CD4+ και CD8+ των συμπτωματικών ζώων, ανεξάρτητα από το αν η ανοσοδιέγερση ήταν μη ειδική (PMA/iono) ή ειδική (LSA). Αντίθετα, η έκφραση της IL-4 ήταν χαμηλή στους μάρτυρες και τα ασυμπτωματικά ζώα ανεξάρτητα από τον τρόπο της ανοσοδιέγερσής τους. Η έκφραση όμως της IL-4 ήταν σημαντικά μεγαλύτερη και στους δύο Τ-λεμφοκυτταρικούς υποπληθυσμούς (CD4+, CD8+) των συμπτωματικών ζώων, όταν η ανοσοδιέγερση έγινε με το LSA σε σύγκριση με την PMA/iono και τα μη ανοσοδιεγερμένα κύτταρα. Τέλος, επισημαίνεται ότι τα ποσοστά των CD8+IL-4+ λεμφοκυττάρων ήταν σημαντικά μεγαλύτερα από τα αντίστοιχα των CD4+IL-4+ κυττάρων τόσο χωρίς, όσο και μετά από την in vitro ανοσοδιέγερση με PMA/iono ή LSA. Στους σκύλους της ομάδας Λ3 και μετά την αντιλεϊσμανιακή θεραπεία, παρατηρήθηκε σχετική αποκατάσταση της ομοιοστασίας του ανοσοφαινότυπού τους, που εκφράσθηκε με την μείωση του ποσοστού των CD8+ T-λεμφοκυττάρων, την αύξηση των CD4+, την αύξηση του λόγου CD4+/CD8+ και την ταυτόχρονη μείωση του ποσοστού και των δύο λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών (CD4+, CD8+) που παράγουν IL-4.