Διερεύνηση μηχανισμών αντοχής στα αντιβιοτικά κλινικών στελεχών streptococcus pneumoniae

Abstract

Objectives: Determination and characterization of the prevalent mechanisms of MLSB, tetracycline and beta-lactam resistance among Streptococcus pneumoniae strains isolated from pediatric infections in Greece during the period 2001-2004.Methods: A total of 1,033 S. pneumoniae strains were isolated in the Departments of the three major Pediatric Hospitals in Athens, Greece. Serotyping was performed by the Quellung reaction. Susceptibility testing to erythromycin, clindamycin and tetracycline was performed using the disk-diffusion method. MLSB resistant phenotypes were detected using the double disk test. Detection of the corresponding resistant mechanisms was performed by PCR amplification of mef, ermB, ermTR, tetM, and tetO genes. Assignment of the mefA/E subtype was performed using PCR-RFLP and the BamH1 restriction endonuclease.The minimal inhibitory concentration (MIC) of penicillin (Pen) and cefotaxime (Ctx) was defined by the antibiotic concentration gradient strips method (E-test, bioMerieux) in Mueller- Hinton agar plates, supplemented with 5% sheep blood. The characterization of resistance mechanisms to β-lactam antibiotics, in the resistant strains to penicillin and/or cefotaxime, was performed by amplification of a 1150 base pairs segment of the PBP1A, 2B and 2X genes with subsequent DNA sequencing. The analysis of the results was performed by the DAMBE software and the use of the ClustalW algorithm.Results: Among the 1,033 S. pneumoniae strains, 186, 641, and 206 were isolated from invasive diseases (bacteremias and meningitis), non-invasive diseases (acute otitis media, eye, and lower respiratory tract) and nasopharyngeal carriage, respectively. Overall, 450 of the 1,033 (43.6%) strains were resistant to erythromycin (EryR). M-phenotype dominated (306/450; 68%), over CR (128/450; 28%) and IR (16/450; 3.6%). The four most frequent serotypes (19F, 14, 6B and 23F), represented 75% of all strains, and included 92% of all EryR strains. M-phenotype prevailed among serotypes 19F and 14 (81% and 64% of EryR strains, respectively), whereas CR-phenotype prevailed among serotypes 6B and 23F (65% and 67% of EryR strains, respectively). Overall tetracycline resistance (TetR) was detected in 358 (35%) of all isolates. The four dominant serotypes (19F, 14, 6B, and 23F) included 94% of all TetR strains, while serotype-specific rates were 74%, 15%, 29%, and 39%, respectively.The mechanisms of resistance were characterized in 273 out of 450 EryR and 207 out of 358 TetR isolates, evenly distributed among serotypes. M, CR and IR-type resistance was attributed to the presence of mef, ermB and ermTR genes in 201 EryR isolates, whereas in 72 isolates (48 M-, 21 CR-, and 3 IR-phenotype) no gene was detected. In addition, 3 CR-phenotype isolates harboured both mefE and ermB gene, whereas a single IR-phenotype isolate harboured both mefE and ermTR. Regarding mef subtype distribution, mefE dominated (86% of mef-positive isolates), but mefA prevailed among serotype 14, whereas among all other serotypes the dominant subtype was mefE. Regarding the 207 TetR isolates, 167 harboured the tetM gene only, 7 harboured both tetM and tetO genes, whereas no gene was detected in 33 isolates.163Total resistance or intermediate susceptibility to penicillin was detected in 12.9% and 31.8% respectively, whereas 1.2% of the strains were resistant to cefotaxime. The resistant strains were categorized in two groups, according to MIC levels, as follows: group A (14 strains) with MIC Pen≥ 2 and MIC Ctx≥ 2, and group B (116 strains) with MIC Pen≥2 and MIC Ctx≤ 1. The analysis of the nucleotide sequence was performed in nine strains of group A and 18 strains of group B, which were randomly chosen. All 19F multiresistant isolates were grouped together, showing very high similarities of all three PBPs, whereas the cefotaxime susceptible isolates showed differences in the nucleotide sequences and were categorized in different groups.Conclusions: Erythromycin resistance among S. pneumoniae in Greece is detected in specific serotypes, and is attributed to efflux mediated mechanism (mef gene) among serotypes 19F and 14, and methylation mediated mechanism (ermB gene) among serotypes 6B and 23F. Tetracycline resistance is also detected in specific serotypes and attributed to ribosomal protection (tetM gene). The 19F multiresistant strains showed highly similar PBP nucleotide sequences and were grouped together, whereas the cefotaxime susceptible-penicillin resistant isolates showed significant differences and were categorized in different groups. Continuous surveillance of the prevalent antibiotic resistance mechanisms is necessary for updating prevention strategies of pneumococcal infections.

Σκοπός: Προσδιορισμός και διερεύνηση των επικρατέστερων μηχανισμών MLSB αντοχής και αντοχής στην τετρακυκλίνη μεταξύ στελεχών Streptococcus pneumoniae, καθώς και των μηχανισμών αντοχής στα β-λακταμικά αντιβιοτικά σε στελέχη Streptococcus pneumoniae που απομονώθηκαν στην Ελλάδα την περίοδο 2001-2004.Μεθοδολογία: Συνολικά 1.033 στελέχη S. pneumoniae απομονώθηκαν από ασθενείς των τριών παιδιατρικών νοσοκομείων της Αθήνας. Η οροτυπία έγινε με εμπορικά διαθέσιμους αντιορούς (αντίδραση Quellung). Ο προσδιορισμός της ευαισθησίας στα αντιβιοτικά ερυθρομυκίνη και κλινδαμυκίνη, τετρακυκλίνη έγινε με την μέθοδο διάχυσης δισκίων κατά Kirby-Bauer, ενώ οι φαινότυποι αντοχής MLSB και TetR, προσδιορίστηκαν με την δοκιμασία επαγωγής διπλού δισκίου. H ελάχιστη ανασταλτική πυκνότητα (ΕΑΠ) της πενικιλλίνης (Pen) και κεφοταξίμης (Ctx) προσδιορίστηκε με τη μέθοδο ταινιών διαβαθμισμένης συγκέντρωσης (E-test, bioMerieux) σε τρυβλία Mueller-Hinton άγαρ εμπλουτισμένο με 5% ερυθρά προβάτου. Η ανίχνευση των MLSB και TetR μηχανισμών αντοχής έγινε με πολλαπλασιασμό τμήματος των γονιδίων mefΑ/Ε, ermB, ermTR, tetO και tetM με την τεχνική της PCR. Προσδιορισμός των υποτύπων του γονιδίου mefA/Ε έγινε μέσω PCR-RFLP και της BamH1 περιοριστικής ενδονουκλεάσης. Η διερεύνηση των μηχανισμών αντοχής στα β-λακταμικά, στα στελέχη που ήταν ανθεκτικά στην πενικιλλίνη ή/και την κεφοταξίμη έγινε με πολλαπλασιασμό τμήματος 1150 ζευγών βάσεων των γονιδίων των πρωτεϊνών PBP1A, 2B και 2X και επακόλουθο προσδιορισμό της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με τo λογισμικό DAMBE και την χρήση του αλγορίθμου ClustalW. Η σύγκριση έγινε με αλληλουχίες προτύπων στελεχών, ευαίσθητων στα β-λακταμικά αντιβιοτικά.Αποτελέσματα: Μεταξύ των 1.033 στελεχών S. pneumοniae, 186, 641 και 206 απομονώθηκαν από διεισδυτικές λοιμώξεις (βακτηριαιμίες και μηνιγγίτιδες), μη διεισδυτικές λοιμώξεις (οξεία μέση ωτίτιδα, οφθαλμικές και λοιμώξεις κατώτερου αναπνευστικού) και από ρινο-φαρυγγική φορεία, αντίστοιχα. Συνολικά, 450 από τα 1.033 (43.6%) στελέχη ήταν ανθεκτικά στην ερυθρομυκίνη (EryR). Ο M φαινότυπος επικρατούσε (306/450, 68%), ενώ ο CR (128/450, 28%) και ο IR (16/450, 3.6%) ακολουθούσαν. Οι τέσσερεις συχνότεροι ορότυποι (19F, 14, 6B και 23F), αντιπροσώπευαν το 75% του συνόλου των στελεχών και περιελάμβαναν το 92% όλων των EryR στελεχών. Ο Μ φαινότυπος κυριαρχούσε μεταξύ των οροτύπων 19F και 14 (81% και 64% των EryR στελεχών από κάθε ορότυπο, αντίστοιχα), ενώ ο CR φαινότυπος κυριαρχούσε μεταξύ των οροτύπων 6B και 23F (65% και 67% των EryR στελεχών από κάθε ορότυπο, αντίστοιχα). Συνολικά, αντοχή στην τετρακυκλίνη (TetR) ανιχνεύθηκε σε 358 (35%) από όλα τα στελέχη. Οι τέσσερεις συχνότεροι ορότυποι (19F, 14, 6B, και 23F) περιελάμβαναν το 94% όλων των TetR στελεχών, ενώ τα ποσοστά ανά ορότυπο ήταν 74%, 15%, 29% και 39%, αντιστοίχως.Ο μοριακός έλεγχος των μηχανισμών αντοχής πραγματοποιήθηκε σε 273 από τα 450 EryR και σε 207 από τα 358 TetR στελέχη, τα οποία κατανέμονταν ομοιόμορφα μεταξύ των οροτύπων.161Η φαινοτυπική αντοχή τύπου M, CR και IR αποδόθηκε στην παρουσία των mef, ermB και ermTR, αντίστοιχα, γονιδίων, σε 201 EryR στελέχη, ενώ σε 72 στελέχη (48 με M , 21με CR και 3 με IR φαινότυπο) δεν ανιχνεύθηκε κανένα γονίδιο. Επιπλέον, σε 3 στελέχη με φαινότυπο CR βρέθηκαν αμφότερα τα γονίδια mefΕ και ermB, ενώ σε ένα στέλεχος με φαινότυπο IR, βρέθηκαν αμφότερα τα γονίδια mefE και ermTR. Όσον αφορά στον προσδιορισμό του mef υποτύπου, επικρατούσε ο mefE (86% των mef-θετικών στελεχών), αλλά ο mefA υπερείχε μεταξύ στελεχών του οροτύπου 14, ενώ μεταξύ των στελεχών όλων των άλλων οροτύπων ο επικρατών υπότυπος ήταν ο mefE. Μεταξύ των 207 TetR στελεχών, 167 παρουσίασαν μόνο το tetM γονίδιο, σε 7 στελέχη βρέθηκαν και τα δύο γονίδια tetM και tetO, ενώ σε 33 από τα στελέχη κανένα γονίδιο δεν ανιχνεύθηκε.Πλήρης αντοχή ή ενδιάμεση ευαισθησία στην πενικιλλίνη ανιχνεύθηκε στο 12,9% και 31,8%, αντίστοιχα, ενώ το 1,2% των στελεχών ήταν ανθεκτικά στην κεφοταξίμη. Τα ανθεκτικά στελέχη κατηγοριοποιήθηκαν σε δύο ομάδες, ανάλογα με τις τιμές ΕΑΠ, ως εξής: ομάδα Α (14 στελέχη) με ΕΑΠ Pen ≥2 και ΕΑΠ Ctx ≥2, και ομάδα Β (116 στελέχη) με ΕΑΠ Pen ≥2 και ΕΑΠ Ctx ≤ 1. Η ανάλυση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας των PBPs 1A,2B και 2X, σε συνολικά εννέα στελέχη της ομάδoς Α και 18 στελέχη της ομάδoς Β, που επιλέχθηκαν τυχαία, έδειξε ότι με βάση τις αλληλουχίες των τριών PBPs, τα πολυανθεκτικά στελέχη οροτύπου 19F της ομάδας Α κατηγοριοποιούνται μαζί, ενώ τα λοιπά στελέχη της ομάδας Β κατηγοριοποιούνται σε διαφορετικούς κλώνους.Συμπεράσματα: Μεταξύ των στελεχών S. pneumoniae που απομονώθηκαν στην Ελλάδα, η αντοχή στην ερυθρομυκίνη ανιχνεύεται σε συγκεκριμένους οροτύπους και αποδίδεται στον μηχανισμό αντλίας εκροής (mef γονίδιο) μεταξύ των οροτύπων 19F και 14 και στον μηχανισμό μεθυλίωσης ριβοσώματος (ermB γονίδιο) μεταξύ των οροτύπων 6B και 23F. Η αντοχή στην τετρακυκλίνη επίσης ανιχνεύεται σε συγκεκριμένους οροτύπους και αποδίδεται σε μηχανισμό προστασίας ριβοσώματος (tetM γονίδιο). Λαμβάνοντας υπ’ όψιν τα αποτελέσματα και των τριών PBPs, μια ομάδα ανθεκτικών και στα δύο β-λακταμικά αντιβιοτικά στελεχών οροτύπου 19F, μαζί με ένα στέλεχος οροτύπου 6Β ομαδοποιούνται μαζί υποδηλώνοντας κοινή καταγωγή των συγκεκριμένων γονιδίων. Αντίθετα, η ομαδοποίηση των λοιπών στελεχών, διαφόρων οροτύπων, με αντοχή στην πενικιλλίνη και ευαισθησία στην κεφοταξίμη δεν είναι σταθερή στις τρεις PBPs. Η συνεχιζόμενη επιτήρηση των επικρατούντων μηχανισμών αντοχής στα αντιβιοτικά, είναι απαραίτητη για την διαρκή προσαρμογή των στρατηγικών πρόληψης στις πνευμονιοκοκκικές λοιμώξεις.