Η επίδραση της κληρονομικότητας στην πρωτοπαθή χολική κίρρωση

Abstract

Introduction: Primary biliary cirrhosis (PBC) is an organ specific autoimmune disease of still unidentified etiology, with genetic and environmental pathogenetic background. Chemicals, infectious agents, hormone therapy, reproductive history and surgical interventions have been implicated in the induction of PBC. Familial PBC has been documented in first degree relatives (FDR). The prevalence of Primary biliary cirrhosis varies in different geographic areas. This might reflect genetic or environmental risk factors.On the other hand, we have shown that endothelins (ETs), produced by the liver endothelial cells are increased in PBC and may play a major pathogenetic role. Aims: Most cohort studies are genetically heterogeneous. Our study aimed a) to determine lifestyle or disease associations and familial occurrence rates in the genetically homogeneous and geographically defined Cretan population of PBC patients, b) to study gene polymorphisms related to the endothelial cells (eNOS, EDN-1 genes) and, to investigate whether the previously reported association with CTLA4 gene polymorphisms is also applicable in our genetically homogeneous population and c) to define PBC prevalence and incidence, describe patient’s spatial distribution, generate prediction maps and detect any possible routing pattern of time-spatial appearance of the disease in Crete, Greece.Methods: From 1990-2010, 245 Primary biliary cirrhosis patients diagnosed and followed up at the Gastroenterology Dept of the University Hospital and the District Hospitals of the island, were contacted and 222 were included in the time-spatial analysis. 111 consenting PBC patients, were compared with 115 FDR and 149 controls matched for age, sex, Cretan origin and residence. All participants completed a questionnaire regarding demographics, lifestyle, medical, surgical and reproductive history. Significant variables on the univariate analysis were analyzed by multivariateanalysis using a forward step-wise logistic regression model. Genomic DNA was extracted from 100 PBC patients (83 females, 93% AMA+, 74/100 Ludwig stage I–II) and 158 healthy controls. eNOS, CTLA4 and ET1 polymorphisms were determined by PCR–RFLPs analysis.To map the spatial distribution of the 222PBC patients per 5-year periods, geospatial models were applied in Gis–ArcMap 9.3 software. Kriging Interpolation methods were used to generate prediction maps for the disease in Crete. Areas of high and low probability of disease occurrence were estimated through multi-criteria modeling. The disease route was defined by Arc map’s toolbox.Results: Dyslipidaemia was found in 69.4% of PBC patients, 60% of FDR and 40.9% of controls (p < 0.0001 and p = 0.003 respectively), autoimmune diseases in 36.9% of patients, 30.4% of FDR and 13.4% of controls (p < 0.0001 and p = 0.011 respectively). Hashimoto’s disease (p = 0.003), Raynaud syndrome (p = 0.023) and Sjögren syndrome (p = 0.044) were significantly associated with PBC. On multivariate analysis statistically significant associations were found with primary educational level (AOR 2.304, 95% CI 1.024-5.181), cholecystectomy (AOR 2.927, 95% CI 1.347-6.362) and the presence of at least another autoimmune disease (AOR 3.318, 95% CI 1.177-6.22). Cancer history was more frequent in patients than in controls (p = 0.033). Familial PBC was found to be 9.9%. Both eNOS intron4 VNTR and eNOS exon7 G894T SNP were significantly associated with increased risk in PBC. EDN-1 rs2071942 ‘‘A’’ and rs5370 ‘‘T’’ alleles appeared a tendency for association with disease progression. No association was found between PBC and the CTLA4 SNPs analyzed. PBC prevalence was found to be 365 cases per million, with a mean incidence of 20.88(range 3.79-35.99). Prediction map estimates from 1.22 to 11 patients per 50 km2 all over Crete. Areas of high risk of disease occurrence are located in the Eastern part, while low risk in the Western part of the islandConclusions: Dyslipidaemia and autoimmune diseases were significantly increased not only in PBC patients as expected but also in their FDR. An increased prevalence of malignancies was found in PBC patients. Primary educational level, cholecystectomy and the presence of at least another autoimmune disease were found as putative risk factors for PBC. No association was found with smoking, urinary tract infection or reproductive history. The reported high familial occurrence of PBC could imply screening with AMA of FDR with at least another autoimmune disease.We also demonstrated that eNOS, a gene related to the liver endothelium function is associated with PBC. In contrast the important in adaptive immunity gene CTLA4 was not associated with the disease in the homogeneous population analyzed. These results are partially compatible with our previous hypothesis that defects of the liver endothelial system, leading to endothelin overproduction, may be a fundamental early pathogenetic mechanism in PBC.Prevalence and incidence of Primary biliary cirrhosis in Crete are among the highest published in Europe. Given the homogeneous and stable study population and the geopolitics of the island, the heterogeneity in the time-spatial distribution and the route of disease appearance strongly suggest a role for environmental causative agents.

Εισαγωγή: Η Π.Χ.Κ. είναι μια όργανο-ειδική αυτοάνοση νόσος αγνώστου αιτιολογίας. Χημικές ουσίες, λοιμώδεις παράγοντες, ορμονοθεραπεία, το αναπαραγωγικό ιστορικό και οι χειρουργικές επεμβάσεις συνιστούν παράγοντες οι οποίοι έχουν συνδεθεί με πιθανή επίδραση στην εμφάνιση της νόσου. Ενδοοικογενειακή εμφάνιση της Π.Χ.Κ. έχει αναφερθεί σε συγγενείς Α βαθμού ασθενών.Σε μελέτη που διεξήχθη στο εργαστήριο Γαστρεντερολογίας της Ιατρικής σχολής Κρήτης βρέθηκε ότι τα επίπεδα των ενδοθηλινών που παράγονται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα του ήπατος είναι αυξημένα στην Π.Χ.Κ. και πιθανά να έχουν κάποιο ρόλο στην παθογένεση της νόσου, ενισχύοντας το ρόλο του γενετικού παράγοντα.Σε συνάρτηση με τα παραπάνω, ο επιπολασμός της Π.Χ.Κ. ποικίλλει σε διαφορετικές γεωγραφικές περιοχές, γεγονός το οποίο πιθανά αντανακλά την επίδραση γενετικών ή περιβαλλοντικών παραγόντων στην εμφάνιση της νόσου.Σκοπός: Οι περισσότερες μελέτες ομάδων (cohort), είναι γενετικά ετερογενείς. Σκοπός της μελέτης μας είναι α) να καθοριστεί πιθανή συσχέτιση της Π.Χ.Κ. με παράγοντες από τις συνήθειες και τον τρόπο ζωής των ασθενών, με άλλα νοσήματα καθώς και να υπολογιστεί το ποσοστό ενδοοικογενειακής Π.Χ.Κ. σε ένα πληθυσμό γενετικά ομοιογενή και γεωγραφικά περιορισμένο όπως είναι ο Κρητικός, β) να μελετηθούν γενετικοί πολυμορφισμοί οι οποίοι σχετίζονται με τα ενδοθηλιακά κύτταρα (γονίδια eNOS, EDN-1 ) και, να διερευνηθεί εάν η συσχέτιση των πολυμορφισμών του γονιδίου CTLA4 αναπαράγεται και στον γενετικά ομοιογενή Ελληνικό πληθυσμό της Κρήτης και γ) να καθοριστεί η επίπτωση και ο επιπολασμός της Π.Χ.Κ. στην Κρήτη, να περιγραφεί η γεωεπιδημιολογική κατανομή των ασθενών στο νησί, να δημιουργηθούν χάρτες πρόβλεψης ύπαρξης της νόσου και να ανιχνευθεί πιθανή χώρο-χρονική πορεία της Π.Χ.Κ. στην Κρήτη, στην Ελλάδα.Μεθοδολογία: Στο διάστημα 1990-2010, από τους 245 ασθενείς με Π.Χ.Κ. που διαγνώστηκαν και παρακολουθούνται στη Γαστρεντερολογική κλινική του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Κρήτης και των Περιφερειακών νοσοκομείων του νησιού, οι 222 συμπεριελήφθησαν στην χώρο-χρονική ανάλυση. 111 εξ αυτών συναίνεσαν να συμμετάσχουν στην κλινική μελέτη συμπληρώνοντας ένα ερωτηματολόγιο με στοιχεία δημογραφικά, τρόπου ζωής, ιατρικό, χειρουργικό και αναπαραγωγικό ιστορικό. Οι ασθενείς αυτοί συγκριθήκαν με 115 συγγενείς Α βαθμού και 149 υγιείς εθελοντές αντίστοιχης ηλικίας, φύλου, Κρητικής καταγωγής και διαμονής. Οι στατιστικά σημαντικές μεταβλητές στην μονοπαραγοντική ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν περαιτέρω σε πολυπαραγοντική, με τη χρήση μοντέλου βηματικής λογιστικής παλινδρόμησης προς τα εμπρός. Επιπλέον εκατό από το σύνολο των ασθενών με Π.Χ.Κ. (83 θήλεα, 93% AMA+, 74/100 σταδίου Ludwig I–II) και 158 υγιείς εθελοντές συναίνεσαν για την εξαγωγή γενομικού DNA προκειμένου να ανιχνευθούν οι πολυμορφισμοί των γονίδιων eNOS, CTLA4 και ET1 με τη χρήση PCR–RFLP.Πιο συγκεκριμένα, για να γίνει η χαρτογράφηση της χώρο-χρονικής κατανομής των 222 ασθενών ανά 5ετια, εφαρμόστηκαν γεωχωρικά μοντέλα στο λογισμικό Gis–ArcMap 9.3. Η μέθοδος χωρικής παρεμβολής Kriging χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία χάρτη πρόβλεψης της Π.Χ.Κ. στην Κρήτη. Οι περιοχές υψηλής ή χαμηλής πιθανότητας για εμφάνιση της νόσου υπολογίστηκαν με πολυπαραγοντικό μοντέλο. Το Arc map’s toolbox λογισμικό εφαρμόστηκε, ώστε να χαραχθεί η χώρο-χρονική πορεία της ΠΧΚ στην Κρήτη.Αποτελέσματα: Όσον αφορά στη μελέτη των συνοσηροτήτων, δυσλιπιδαιμία βρέθηκε στο 69.4% των ασθενών με Π.Χ.Κ., στο 60% των συγγενών Α βαθμού και στο 40.9% της ομάδας ελέγχου(p < 0.0001 και p = 0.003 αντίστοιχα), συνοδά αυτοάνοσα νοσήματα στο 36.9% των ασθενών, στο 30.4% των συγγενών Α βαθμού και στο 13.4% της ομάδας ελέγχου(p < 0.0001 και p = 0.011 αντίστοιχα). Η θυρεοειδίτιδα Hashimoto(p = 0.003), το σύνδρομο Raynaud(p = 0.023) και Sjögren(p = 0.044) είχαν στατιστικά σημαντική συσχέτιση με την Π.Χ.Κ. Στην πολυπαραγοντική ανάλυση βρέθηκαν στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις της νόσου με την πρωτοβάθμια εκπαίδευση (χαμηλό επίπεδο εκπαίδευσης) (AOR 2.304, 95% CI 1.024-5.181), με τη χολοκυστεκτομή(AOR 2.927, 95% CI 1.347-6.362) και με τη συνύπαρξη τουλάχιστον ενός άλλου αυτοανοσου νοσήματος (AOR 3.318, 95% CI 1.177-6.22). Ιστορικό κακοήθειας βρέθηκε με μεγαλύτερη συχνότητα στους ασθενείς με Π.Χ.Κ. σε σύγκριση με τους υγιείς εθελοντές(p = 0.033). Η ενδοοικογενειακή εμφάνιση Π.Χ.Κ. στην Κρήτη υπολογίστηκε σε 9.9%. Από τη μελέτη των γενετικών πολυμορφισμών τόσο το eNOS intron4 VNTR όσο και το eNOS exon7 G894T SNP βρέθηκε ότι σχετίζονται σημαντικά με αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης Π.Χ.Κ. Τα αλληλομορφα EDN-1 rs2071942 ‘‘A’’ και rs5370 ‘‘T’’ έδειξαν μια τάση για συσχέτιση με το στάδιο της νόσου. Καμία συσχέτιση δεν βρέθηκε ανάμεσα στην Π.Χ.Κ. και στους πολυμορφισμούς CTLA4 που μελετήθηκαν. Ο επιπολασμός της Π.Χ.Κ. στην Κρήτη προσδιορίστηκε στις 365 περιπτώσεις ανά 1.000.000 πληθυσμού και η μέση επίπτωση 20.88(εύρος 3.79-35.99). Οι χάρτες πρόβλεψης υπολογίζουν από 1.22 έως 11 ασθενείς ανά 50 km2 στην Κρήτη. Οι περιοχές υψηλού κινδύνου για εμφάνιση της νόσου βρίσκονται στο ανατολικό τμήμα του νησιού, ενώ οι χαμηλού κινδύνου στο δυτικό τμήμα.Συμπεράσματα: Η δυσλιπιδαιμία και τα συνοδά αυτοάνοσα νοσήματα ήταν σημαντικά αυξημένα όχι μόνο στους ασθενείς με Π.Χ. Κ. όπως αναμενόταν, αλλά και στους συγγενείς Α βαθμού. Επιπλέον, αυξημένα ποσοστά κακοηθειών είχαν οι ασθενείς με Π.Χ. Κ. Ως πιθανοί παράγοντες κινδύνου για τη νόσο βρέθηκαν η πρωτοβάθμια εκπαίδευση, η χολοκυστεκτομή και η παρουσία τουλάχιστον ενός άλλου αυτοάνοσου νοσήματος. Δεν διεπιστώθη συσχέτιση της Π.Χ.Κ. με το κάπνισμα, τις λοιμώξεις ουροποιητικού ή το αναπαραγωγικό ιστορικό. Λόγω των υψηλών ποσοστών ενδοοικογενειακής εμφάνισης της νόσου στην Κρήτη προτείνεται προληπτικός έλεγχος AMA στους συγγενείς Α βαθμού στους οποίους συνυπάρχει τουλάχιστον ένα άλλο αυτοάνοσο νόσημα.Επίσης δείξαμε ότι το γονίδιο eNOS, το οποίο επιδρά στη λειτουργία του ενδοθηλίου του ήπατος σχετίζεται με την εμφάνιση PBC στον Κρητικό πληθυσμό, όχι όμως και το σχετιζόμενο με την επίκτητη ανοσία γονίδιο CTLA4. Η επίπτωση και ο επιπολασμός της Π.Χ.Κ. στην Κρήτη είναι από τους μεγαλύτερους στην Ευρωπαϊκή βιβλιογραφία. Με δεδομένο την ομοιογένεια του υπό μελέτη πληθυσμού και τα γεωπολιτικά χαρακτηριστικά του νησιού, η παρατηρηθείσα ετερογένεια στην χώρο-χρονική κατανομή και στην πορεία της νόσου, ενισχύει την υπόθεση της επίδρασης περιβαλλοντικών παραγόντων στην αιτιολογία της Π.Χ.Κ.