Μελέτη επί της παρουσίας των Culicidae στην Ελλάδα, της μοριακής ταξινόμησης αυτών και της εποχικής διακύμανσης και του κρατούντος συστήματος αντιμετώπισής τους στους ορυζώνες: αξιολόγηση βιοκτόνων κατά του Aedes albopictus (Diptera: Culicidae)

Abstract

Studies of mosquito fauna of Greece started early in the previous century by Greek and foreign researchers shortly after the discovery of the role of species of the genus Anopheles in the transmission of malaria. The most recent list of species of mosquitoes living in Greece, which introduced in 2011, comprises 64 species classified into two subfamilies and 8 genera. In the present study an effort was undertaken to update and possibly enrich the existed list of Culicidae which are presented in Greece. For this reason were performed random mosquitoes’ samplings from April 2009 to August of 2012 to 25 Regional Units of Greece. An attempt was made to be covered large range of natural mosquito breeding habitats (delta of rivers, lakes, streams, wells, urban environments, permanent and non permanent water collections). During the study were collected more than 5,200 individuals including larvae, nymphs and adults of mosquitoes. Twenty four mosquito species were identified belonging to 6 different genera (Culex, Aedes, Ochlerotatus, Anopheles, Culiseta and Uranotaenia). The most abundant species was Culex pipiens, found in almost all breeding sites sampled. Among the species identified most of them are of medical importance since they can be potential vectors of serious human diseases. Several problems are presented frequently in the identification of organisms by using morphometric characters. For that reason have been introduced new techniques involving genetic material. These are usually aimed at analysis of the genetic material, but also to derivatives of it such as proteins and enzymes. In order to contribute the present study in the molecular classification of Culicidae species of Greece was conducted molecular analysis of three mosquito species. The species that were classified by molecular techniques were Culex tritaeniorhynchus, Culex laticinctus and Ochlerotatus zammitti. The individuals of the species Cx. tritaeniorhynchus, Oc. zammitti and Cx. laticinctus were collected from the Regional Units of Aitoloakarnania, East Attica and Chania respectively. In the present work was also studied the mosquito species composition and their seasonal abundance in a rice field in western Greece over a three year period (2009-2011). A total of 11,716 larvae and pupae of mosquitoes were recorded, belonging to 4 genera and 7 species (Ochlerotatus caspius, Anopheles hyrcanus, Anopheles sacharovi, Culex theileri, Culex tritaeniorhynchus, Culex pipiens, Uranotaenia unguiculata). Cx. tritaeniorhynchus constituted the most abundant species. It is the second recorded occurrence of this species in Greece, but the first time that a high population of this mosquito species is recorded in the country. In all three years, the total population density of mosquitoes was found to be higher in early August. The number of immatures of all species was found higher in 2009 and 2010 than in 2011, as well was that of the Cx. tritaeniorhynchus adults derived from the rearing of the collected immatures. This regularity is probably due to the lack of water in the rice field in early August 2011. Cx. tritaeniorhynchus was found to be the most abundant species after the rearing of immatures representing 85.1%, 93.5% and 96.1% of the total number of the mosquito adults in 2009, 2010 and 2011, respectively. The rice culturing practices may have affected the seasonal occurrence of mosquito immatures in all of the study years. In the present PhD thesis was also conducted a recording of the system and of the mosquitoes control methods that were used in rice fields in Greece. In order to be gathered the necessary data questionnaires were sent to several private or government agencies (companies that undertake the control of mosquitoes in rice fields in the country, the Departments of Rural Economy and Veterinary where rice is cultivated, the Ministry of Rural Development and Food and in rice mills). From their responses and also from other sources were reported the problems of the system while in the study are also listed suggestions for its improvement, both at organizational and at operational level. Finally, in this study three insecticides spinosad, diflubenzuron and methoprene were tested about their toxicity to Aedes albopictus late 3rd and early 4th instars larvae in laboratory bioassays. The larvae were from a laboratory colonized population of Aedes albopictus collected from Aitoloakarnania. The insecticides were tested at the labeled use rates (0.0984ppm, 0.1014ppm and 0.0234ppm respectively) and at the 1/4, 1/16 and 1/64 of these. The LC50 and LC90 values of spinosad were 0.0131ppm and 0.0341ppm respectively after 24 hours of exposure while after 48 hours the respective values were 0.0106ppm and 0.0239ppm. The EI50 and EI90 values of diflubenzuron were 0.0002ppm and 0.0031ppm respectively while for methoprene the respective values were 0.0010ppm and 0.0104ppm. The toxical action of spinosad was considerably rapid causing very high level of larval mortality after 24h of exposure at the labelled use rate and at the 1/4 of it (97.5% and 88.3% mortality respectively). The LT50 values of diflubenzuron and methoprene were ranged, according to the insecticide’s dose, from 48 to 63 hours and from 64 to 321 hours respectively. All the insecticides at labelled use rates exhibit high toxicity to Aedes albopictus larvae. Seven days after treatment the mortalities obtained from spinosad, diflubenzuron and methoprene were 99.6%, 99.2% and 97.9% respectively. At the 1/4 of the labelled use rates spinosad and diflubenzuron remain very toxic and their toxicity was higher than that of methoprene. Seven days after treatment at the 1/16 and at the 1/64 of the labelled use rates only diflubenzuron exhibits high level of toxicity (97.1% and 81.7% mortality respectively) and it were higher than those of the other two insecticides.

Οι πρώτες προσπάθειες για την καταγραφή των κουνουπιών που ενδημούν στη χώρα μας ξεκίνησαν από Έλληνες και ξένους ερευνητές στις αρχές του 20ου αιώνα, αμέσως μετά την ανακάλυψη του ρόλου των ειδών του γένους Anopheles στη μετάδοση της ελονοσίας. Ο τελευταίος κατάλογος των ειδών κουνουπιών που διαβιούν στην Ελλάδα συντάχθηκε το 2011 και περιλαμβάνει 64 είδη ταξινομημένα σε 2 υποοικογένειες και 8 γένη. Στην παρούσα μελέτη επιχειρήθηκε η επικαιροποίηση της καταγραφή της εξάπλωσης των ειδών των κουνουπιών στην Ελλάδα. Για τον σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκαν τυχαίες δειγματοληψίες για τη συλλογή κουνουπιών από τον Απρίλιο του 2009 έως και τον Αύγουστο του 2012 σε 25 συνολικά Περιφερειακές Ενότητες ενώ έγινε προσπάθεια να καλυφθεί όσο το δυνατό μεγαλύτερο εύρος εστιών ανάπτυξης των κουνουπιών (δέλτα ποταμών, λίμνες, ρέματα, πηγάδια, αστικά περιβάλλοντα, μόνιμες και μη συλλογές νερού). Κατά τη διάρκεια της μελέτης συλλέχθηκαν περισσότερα από 5.200 δείγματα (άτομα) προνυμφών, νυμφών και τελείων κουνουπιών. Από το σύνολο των ατόμων που εξετάστηκαν, αναγνωρίσθηκαν 24 είδη κουνουπιών, από 6 διαφορετικά γένη (Anopheles, Culex, Aedes, Ochlerotatus, Culiseta και Uranotaenia). Το είδος Culex pipiens εντοπίστηκε σε όλες σχεδόν τις εστίες από τις οποίες λήφθηκε δείγμα. Επίσης, τα περισσότερα από τα ευρεθέντα είδη είναι σημαντικά από υγειονομική άποψη καθώς μπορούν να αποτελέσουν φορείς σοβαρών ασθενειών που προσβάλλουν τον άνθρωπο. Λόγω των προβλημάτων που αρκετές φορές παρουσιάζονται με τη χρησιμοποίηση των μορφομετρικών χαρακτήρων για την ταξινόμηση των οργανισμών χρησιμοποιούνται πλέον και τεχνικές που αφορούν το γενετικό υλικό. Αυτές συνήθως στοχεύουν στην ανάλυση του γενετικού υλικού, αλλά πολλές φορές και σε παράγωγά του, όπως είναι οι πρωτεΐνες και τα ένζυμα. Στην παρούσα εργασία έγινε μοριακή ανάλυση τριών ειδών κουνουπιών με στόχο την συμβολή της μελέτης στη μοριακή ταξινόμηση ειδών Culicidae στην Ελλάδα. Τα είδη που ταξινομήθηκαν με μοριακές τεχνικές ήταν τα Culex tritaeniorhynchus, Culex laticinctus και Ochlerotatus zammitti. Τα άτομα του είδους Cx. tritaeniorhynchus συλλέχθηκαν από την Π.Ε. Αιτωλοακαρνανίας, το είδος Oc. zammitti από την Π.Ε. Ανατολικής Αττικής και το είδος Cx. laticinctus από την Π.Ε. Χανίων. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν επίσης η μελέτη της σύνθεσης των ειδών κουνουπιών και η εποχική διακύμανση αυτών κατά τα έτη 2009, 2010 και 2011 σε ορυζώνα βιολογικής καλλιέργειας στην περιοχή Νεοχωρίου της Π. Ε. Αιτωλοακαρνανίας. Συλλέχθηκαν συνολικά 11.716 προνύμφες και νύμφες κουνουπιών που ανήκαν σε 4 γένη και 7 είδη (Ochlerotatus caspius, Anopheles hyrcanus, Anopheles sacharovi, Culex theileri, Culex tritaeniorhynchus, Culex pipiens, Uranotaenia unguiculata). Το είδος Cx. tritaeniorhynchus που ήταν το πολυπληθέστερο καταγράφηκε για δεύτερη φορά στην Ελλάδα αλλά είναι η πρώτη φορά που καταγράφηκαν υψηλές πληθυσμιακές πυκνότητες του είδους αυτού στη χώρα μας. Κατά τη διάρκεια και των 3 ετών της μελέτης η πληθυσμιακή πυκνότητα των ατελών των κουνουπιών ήταν υψηλότερη τον Αύγουστο. Ο αριθμός των ατελών όλων των ειδών ήταν υψηλότερος το 2009 και το 2010 σε σχέση με το 2011 καθώς και των τελείων του είδους Cx. tritaeniorhynchus που προέκυψαν μετά την εκτροφή των ατελών σταδίων που συλλέχθηκαν. Αυτό πιθανώς οφείλεται στην έλλειψη νερού που σημειώθηκε στον αγρό στις αρχές Αυγούστου του 2011. Το είδος Cx. tritaeniorhynchus ήταν το είδος με τη μεγαλύτερη αφθονία μετά την εκτροφή των ατελών, αποτελώντας το 85,1%, 93,5% και 96,1% του συνολικού αριθμού των τελείων κουνουπιών για το 2009, το 2010 και το 2011, αντίστοιχα. Οι καλλιεργητικές τεχνικές που εφαρμόζονται στους ορυζώνες πιθανότατα επηρέασαν την εποχική εμφάνιση των ατελών των κουνουπιών και τα 3 έτη της μελέτης. Επίσης, στην παρούσα διατριβή έγινε μια καταγραφή του συστήματος και των μεθόδων αντιμετώπισης των κουνουπιών στους ορυζώνες στη χώρα μας. Για να συλλεγούν τα απαραίτητα στοιχεία συντάχθηκαν ερωτηματολόγια και απεστάλησαν σε όλους τους εμπλεκόμενους φορείς (σε εταιρείες που αναλαμβάνουν έργα αντιμετώπισης κουνουπιών σε ορυζώνες της χώρας, στις Διευθύνσεις Αγροτικής Ανάπτυξης και Κτηνιατρικής, στα διοικητικά όρια των οποίων καλλιεργείται ρύζι, στο Υπουργείο Αγροτικής Ανάπτυξης και Τροφίμων και σε ορυζόμυλους. Από τις απαντήσεις που δόθηκαν καθώς και από άλλες πηγές καταγράφηκαν τα προβλήματα του συστήματος ενώ στην μελέτη παρατίθενται και προτάσεις για τη βελτίωσή του, τόσο σε οργανωτικό όσο και σε επιχειρησιακό επίπεδο. Τέλος εξετάστηκαν τρία εντομοκτόνα σκευάσματα με δραστικές ουσίες το spinosad, το diflubenzuron και το methoprene σε σχέση με την τοξικότητά τους σε προνύμφες 3ου–4ου σταδίου του Aedes albopictus σε εργαστηριακές συνθήκες. Οι προνύμφες που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα προέρχονταν από εργαστηριακή εκτροφή η οποία προήλθε από άτομα του Aedes albopictus τα οποία συλλέχθηκαν στην περιοχή της Αιτωλοακαρνανία. Τα εντομοκτόνα εξετάστηκαν στις συνιστώμενες δόσεις σύμφωνά με την ετικέτα τους (0.0984ppm, 0.1014ppm και 0.0234ppm αντίστοιχα) καθώς και στο 1/4, 1/16 και 1/64 αυτών. Οι τιμές των LC50 και LC90 του spinosad μετά από 24 ώρες έκθεσης των προνυμφών ήταν 0.0131ppm και 0.0341ppm αντίστοιχα ενώ μετά από 48 ώρες οι αντίστοιχες τιμές ήταν 0.0106ppm και 0.0239ppm. Οι τιμές των EI50 και EI90 του diflubenzuron ήταν 0.0002ppm και 0.0031ppm αντίστοιχα ενώ για το methoprene οι αντίστοιχες τιμές βρέθηκαν να είναι 0.0010ppm και 0.0104ppm. Η τοξική δράση του spinosad στην συνιστώμενη δόση και στο 1/4 αυτής ήταν ιδιαίτερα ταχεία προκαλώντας πολύ υψηλή θνησιμότητα στις προνύμφες μετά από 24 ώρες έκθεσης (97.5% και 88.3% θνησιμότητες αντίστοιχα). Οι τιμές LT50 κυμάνθηκαν ανάλογα με την δόση του εντομοκτόνου από 48 έως 63 ώρες για το diflubenzuron και από 64 έως 321 ώρες για το methoprene. Όλα τα σκευάσματα που εξετάσθηκαν στις συνιστώμενες δόσεις επέδειξαν υψηλή τοξικότητα στις προνύμφες του Aedes albopictus. Επτά ημέρες μετά την εφαρμογή τους οι θνησιμότητες που παρατηρήθηκαν από την δράση του spinosad, του diflubenzuron και του methoprene ήταν 99.6%, 99.2% και 97.9% αντίστοιχα. Στο 1/4 της συνιστώμενης δόσης το spinosad και το diflubenzuron παρέμειναν πολύ τοξικά και η τοξικότητές τους ήταν υψηλότερες από αυτή του methoprene. Επτά ημέρες μετά την εφαρμογή των εντομοκτόνων στο 1/16 και στο 1/64 της συνιστώμενης δόσης μόνο το diflubenzuron επέδειξε υψηλές τοξικότητες (97.1% και 81.7% θνησιμότητες αντίστοιχα) και ήταν υψηλότερες από αυτές που εμφάνισαν τα δύο άλλα σκευάσματα.