Ανταγωνιστές μπομπεσίνης επισημασμένοι με 99mTc για εφαρμογή στη διαγνωστική ογκολογία

Abstract

In recent years important progress has been made in diagnostic oncology byapplying specialized site-specific radiolabeled compounds. Research is mainlyfocusing on the development of radiolabeled peptides because they offer severaladvantages such as rapid biokinetics, high penetration capacity into cancer tissuedue to their low molecular weight and low antigenicity. Radiopeptides interactselectively with target-biomolecules (peptide receptors) which are overexpressed onthe surface of cancer cells. Therefore, they act as transporters of diagnostic ortherapeutic radionuclides to the target (malignant lesions), providing the possibility ofhigh contrast imaging or cell damage.Bombesin is a 14-amino acid peptide with high affinity for gastrin releasingpeptide receptors (GRP-Rs) which are overxpressed in a variety of human tumorsincluding prostate and breast cancers.In the present thesis, the synthesis and preclinical evaluation of novelbombesin antagonists radiolabeled with 99mTc for potential application in targeteddiagnostic imaging of GRP-R+tumors, is described.Synthesis of the new peptides was based on the bombesin antagonist peptide[D-Phe6,Leu-NHEt13]BBN(6-13) and modifications occurred at the N-terminus, Cterminusand/or at the peptide chain of this antagonist.The radionuclide of choice was 99mTc because of its ideal nuclear properties. Abifunctional tetraamine precursor H2NCH2CH2NH(CH2)3NHCH2CH2NH2 (2,3,2-tet)was used for the stable binding of 99mTc. Incorporation of 99mTc by the tetraamine unitwas almost quantitative as it was confirmed by chromatographic analysis.Binding affinity of the new analogs for the GRP-R was studied withcompetition binding experiments in PC-3 cell membranes and it was high, evenhigher than the peptide of reference [Tyr4]BBN. These results show the favorableeffect of the tetraamine complex at the N-terminus of the new peptides. Also thebinding affinity of the radiolabeled peptide was studied for [99gTc/99mTc]Demobesin 8by saturation binding experiments in whole PC-3 cells and it was significantly high (Kd= 0.24±0.03 nM) indicating that the presence of the [TcV(O)2N4)]+ complex at the Nterminusof the peptide affects positively the binding affinity to GRP-R.Metabolic studies for [99mTc]Demobesin 8 were conducted in mouse plasma,kidney homogenates and urine. [99mTc]Demobesin 8 survived long enough inmouse plasma, whereas in kidney homogenates it rapidly degraded in hydrophilic metabolites and it is finally excreted into urine. HPLC analysis in urine that werecollected 30 min after the intravenous injection of the radiopeptide showed fulldegradation in the kidneys.Biodistribution studies in healthy and pathological animal models afterintravenous injection of the radiolabeled peptides confirmed the in vitro results. Theradioactivity rapidly cleared from the blood and background tissues and it wasexcreted mainly via kidneys and the urinary system.As it was mentioned before the main route of excretion of [99mTc]Demobesin 8is via the kidneys and the urinary system and not through the hepatobiliary systemdue to high hydrophilicity. This is expected to lead in rapid excretion from backgroundtissues and hence a possible better imaging of GRP-R positive tumors. Also higheruptake in organs that expressing GRP-R such as pancreas was observed for[99mTc]Demobesin 8. The process was GRP-R mediated, as shown by in vivoreceptor blockade by co-injection of excess of [Tyr4]BBN with each radiopeptide. InSCID mice bearing human PC-3 xenografts expressing the human GRP-R,[99mTc]Demobesin 8 achieved the higher uptake in tumor.In comparison with other radiolabeled bombesin antagonists, which are knownin the literature, [99mTc]Demobesin 8 showed the highest binding affinity for GRP-Rand also in vivo the highest tumor uptake. Moreover compared with agonistradiopeptides such as [99mTc]Demobesin 3-6 showed the more effective targeting ofGRP-R by antagonist peptides.In conclusion, this thesis successfully led in the development of new 99mTcradiolabeledbombesin antagonists for diagnostic imaging of GRP-R positive tumorsin human. This preclinical evaluation showed as the radiopeptide of choice[99mTc]Demobesin 8 because satisfied important criteria and combined a variety offavorable properties for successful application in the targeted diagnostic imaging ofGRP-R positive tumors such as favorable pharmacokinetics, metabolic stability aswell as rapid and high in vivo GRP-R targeting which can led to satisfactory tumorimages

Τα τελευταία χρόνια έχει παρατηρηθεί πολύ μεγάλη πρόοδος στη διαγνωστικήογκολογία με την εφαρμογή εξειδικευμένων ραδιοεπισημασμένων ενώσεων(ραδιοφαρμάκων) μοριακής στόχευσης. Κυρίως η έρευνα επικεντρώνεται στηνανάπτυξη ραδιοεπισημασμένων πεπτιδίων τα οποία παρουσιάζουν πολλάπλεονεκτήματα για εφαρμογή στη κλινική ογκολογία, όπως ταχεία βιοκινητική, μεγάληικανότητα διείσδυσης στον καρκινικό ιστό λόγω μικρού μοριακού βάρους και χαμηλήαντιγονικότητα. Τα ραδιοπεπτίδια αλληλεπιδρούν επιλεκτικά με βιομόρια-στόχους,δηλαδή πρωτεϊνικούς υποδοχείς, οι οποίοι υπερεκφράζονται στην επιφάνεια τωνκαρκινικών κυττάρων. Επομένως λειτουργούν ως μεταφορείς διαγνωστικών ήθεραπευτικών ραδιονουκλιδίων στους ιστούς στόχους (καρκινικές εστίες),παρέχοντας δυνατότητα απεικόνισης τους ή και καταστροφής τους.Η μπομπεσίνη (BBΝ) είναι ένα δεκατετραπεπτίδιο με μεγάλη συγγένεια γιατους υποδοχείς του γαστρινοεκλυτικού πεπτιδίου (GRP-Rs) οι οποίοιυπερεκφράζονται σε πολλούς συνήθεις ανθρώπινους όγκους, όπως σε καρκίνο τουπροστάτη και του μαστού.Στη παρούσα διατριβή περιγράφεται η σύνθεση και η προκλινική αξιολόγησηνέων ανταγωνιστών μπομπεσίνης επισημασμένων με 99mTc για εφαρμογή στηστοχευμένη απεικονιστική διάγνωση GRP-R θετικών όγκων.Ως οδηγός-ένωση χρησιμοποιήθηκε ο ανταγωνιστής μπομπεσίνης [DPhe6,Leu-NHEt13]BBΝ(6-13), στην οποία έγιναν επεμβάσεις στο N-τελικό άκρο, στοC-τελικό άκρο και/ή στη πεπτιδική αλυσίδα.Ως ραδιονουκλίδιο επιλέχθηκε το 99mTc λόγω των ιδανικών του πυρηνικώνιδιότητων. Για τη σταθερή συναρμογή του 99mTc χρησιμοποιήθηκε τετραμίνη ανοικτήςαλυσίδας τύπου H2NCH2CH2NH(CH2)3NHCH2CH2NH2 (2,3,2-tet). Η επισήμανση ήτανσχεδόν ποσοτική και τα επισημασμένα πεπτίδια παραλήφθηκαν σε υψηλήκαθαρότητα όπως επιβεβαιώθηκε με ραδιοχημικό έλεγχο.Η συγγένεια των νέων αναλόγων για τον GRP-R μελετήθηκε με πειράματαανταγωνιστικής δέσμευσης έναντι [125Ι-Τyr4]BBN σε μεμβράνες κυττάρων PC-3 καιβρέθηκε ιδιαίτερα υψηλή, υψηλότερη ακόμα και από την ένωση αναφοράς [Tyr4]BBΝκαταδεικνύοντας την ευνοϊκή επίδραση του τετραμινικού υποκαταστάτη στο N-τελικό άκρο των πεπτιδίων αυτών. Η ικανότητα δέσμευσης μετά τη συναρμογή τουραδιομετάλλου μελετήθηκε αντιπροσωπευτικά για το [99gTc/99mTc]Demobesin 8 μεπειράματα δέσμευσης κορεσμού υποδοχέων σε κύτταρα PC-3. Η συγγένειαδέσμευσης για τον GRP-R ήταν ιδιαίτερα υψηλή, με τιμή Kd = 0.24±0.03 nM,καταδεικνύοντας ότι η παρουσία του (ραδιο)μεταλλικού συμπλόκου στο Ν-τελικόάκρο της πεπτιδικής αλυσίδας ευνοεί τη δέσμευση στον GRP-R.Πειράματα δέσμευσης των ραδιοπεπτιδίων της παρούσας διατριβής σεκύτταρα PC-3 έδειξαν ποσοστά δέσμευσης ανάλογα της συγγένειας του κάθεαναλόγου και την απουσία εσωτερίκευσης, η οποία είναι συμβατή με συμπεριφοράανταγωνιστή. Η ανταγωνιστική δράση επιβεβαιώθηκε επιλεκτικά για τα Demobesin 8και Demobesin 10 σε κύτταρα HEK-GRPR.Η μεταβολική σταθερότητα του [99mTc]Demobesin 8 μελετήθηκε σε πλάσμααίματος, ομογενοποίημα νεφρών ποντικού και ούρα ποντικιού. Το [99mTc]Demobesin8 αποικοδομείται αργά στο πλάσμα ενώ στα νεφρά αποικοδομείται ταχέως σευδρόφιλους μεταβολίτες. Ανάλυση με HPLC ούρων που συλλέχθηκαν 30 min μετάτην ενδοφλέβια χορήγηση του ραδιοπεπτιδίου έδειξε πλήρη αποικοδόμησή του.Τα αποτελέσματα των μελετών βιοκατανομής κατά την ενδοφλέβια χορήγησητων επισημασμένων αναλόγων σε υγιή και παθολογικά πρότυπα πειραματοζώωνσυμφωνούν με τα αποτελέσματα των μελετών in vitro. Διαπιστώθηκε ταχείααπομάκρυνση από το αίμα και το υπόστρωμα με κύρια οδό απέκκρισης τοουροποιητικό σύστημα.Η κύρια οδός απέκκρισης του [99mTc]Demobesin 8 είναι διαμέσου των νεφρώνπρος τα ούρα και όχι μέσω του ηπατοχολικού συστήματος λόγω υψηλήςυδροφιλικότητας. Αυτό αναμένεται να οδηγήσει σε ταχύτερη κάθαρση και σε μείωσητης ραδιενέργειας υποστρώματος άρα και σε πιθανή ευκρινέστερη απεικόνιση GRPRθετικών όγκων. Η υψηλότερη ειδική πρόσληψη στα όργανα που εκφράζουνφυσιολογικά τον GRP-R όπως είναι το πάγκρεας παρατηρήθηκε για το[99mTc]Demobesin 8. Η διαδικασία για όλα τα ραδιοπεπτίδια διαμεσολαβείται απότους GRP-Rs, όπως αποδείχθηκε κατόπιν in vivo αποκλεισμού των θέσεωνδέσμευσης με συγχορήγηση περίσσειας [Tyr4]BBΝ με το εκάστοτε ραδιοπεπτίδιο. Σεποντίκια τύπου SCID στα οποία έχουν μεταμοσχευθεί ανθρώπινα ετερομοσχεύματαPC-3 το [99mTc]Demobesin 8 πέτυχε και πάλι τις υψηλότερες τιμές πρόσληψης στονόγκο. Σε σύγκριση με άλλα πεπτίδια ανταγωνιστές μπομπεσίνης της βιβλιογραφίαςτο [99mTc]Demobesin 8 έδειξε υψηλότερη συγγένεια δέσμευσης για τον GRP-R καιυψηλότερες τιμές πρόσληψης στον πειραματικό όγκο. Επιπλέον σύγκριση με ταραδιοπεπτίδια - αγωνιστές όπως [99mTc]Demobesin 3-6 επιβεβαιώνει τηναποτελεσματικότερη στόχευση GRP-R - θετικών καρκινωμάτων από ραδιοπεπτίδια-ανταγωνιστές.Η παρούσα διατριβή οδήγησε με επιτυχία στην ανάπτυξη νέων 99mTc-ραδιοεπισημασμένων ανταγωνιστών μπομπεσίνης για εφαρμογή στη στοχευμένηαπεικονιστική διάγνωση GRP-R θετικών όγκων στον άνθρωπο. Η προκλινική αυτήαξιολόγηση κατέδειξε ως ραδιοπεπτίδιο επιλογής το [99mTc]Demobesin 8 δεδομένουότι συνδυάζει σημαντικά κριτήρια για κλινική εφαρμογή, όπως σταθερότητα, ταχείακαι υψηλή in vivo στόχευση των GRP-Rs και ταχεία κάθαρση από παρακείμενουςιστούς και επομένως σε υψηλής ευκρίνειας απεικονίσεις.