Επίδραση του όζοντος, του αιθυλενίου και του 1-μεθυλκυκλοπροπενίου στη μετασυλλεκτική συμπεριφορά καρπών ακτινιδιάς (Actinidia deliciosa ποικ. Hayward)

Abstract

Ozone-enriched (0,3 μL L-1) cold storage atmosphere inhibited ethylene biosynthesis during kiwifruit ripening at room temperature. This ozone response was accompanied with basal 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) accumulation due to the inhibition of ACC synthase (ACS) enzyme activity, whereas RT-qPCR analysis further revealed that ACS1 transcription was down-regulated by ozone. Both ACC oxidase (ACO) activity and ACO1 expression were depressed by ozone, particularly evidenced during 6 d ripening. Ozone-exposure also resulted in reduced kiwifruit softening rate and prevented flesh breakdown symptoms. Fruit exposed to ozone displayed higher alcohol insoluble residue (AIR), lower cell wall swelling, reduced pectin solubilization along with reduced hemicellulose degradation during ripening. Furthermore, polygalacturonase (PG) and endo-1,4-b-glucanase/1,4-b-glucosidase (EGase/Glu) enzyme activities were depressed in ozone-treated fruit at specific ripening stages. To characterize the impact of ozone on kiwifruit proteome changes during ripening following cold storage a proteomic analysis approach using one-dimensional gel electrophoresis (1D-SDS-PAGE) and mass spectrometry was performed. This approach provided the first draft of kiwifruit proteome, thus making the first step toward understanding the role of this molecule in kiwifruit ripening. This proteomic analysis approach allowed the identification of 102 kiwifruit proteins during ripening, which are mainly involved in energy, protein metabolism, defense and cell structure. Additionally, ripening induced protein carbonylation in kiwifruit but this effect was depressed by ozone whereas 14 candidate kiwifruit proteins that are sensitive to carbonylation were also characterized. Four of these candidates for carbonylation kiwifruit proteins have been reported to act as allergenic agents. As a next stage of experimental approach, the application of 1-MCP was used to understand the role of ozone of kiwifruit ethylene biosynthesis, whereas a more comprehensive proteomic analysis based on two-dimensional gel electrophoresis (2D-SDS-PAGE) was developed. Results showed that both ozone and 1-MCP postharvest treatment inhibited endogenous ethylene production during kiwifruit ripening (20 oC), delayed flesh softening and soluble solids content accumulation compared to control fruit. Furthermore, it was revealed that the combination of these treatments (1-MCP + Οzone) caused the stronger inhibition on kiwifruit ripening. Additionally, it was evidenced that external ethylene treatment caused a rapid increase in ‘autocatalytic’ ethylene production in the fruit that previously was stored in an ozone-enriched atmosphere revealing that ozone act as a biochemical inhibitor on ethylene biosynthesis during kiwifruit ripening. Proteomic results revealed that postharvest treatments (1-MCP, Οzone, 1-MCP + Οzone) modulated the abundance of 51 protein spots of the kiwifruit proteomic map, whereas external ethylene treatment changed the abudance of 99 proteomic spots in fruits exposed to all treatments. The 2D-PAGE approach employed in the present study was further used to characterize the proteomic changes in kiwifruits that induced by ethylene or chilling treatment. Both postharvest treatments elicited ripening after 10 d at 20 oC, while control fruit ripened after 20 d after harvest. Proteomic analysis showed that treatments elicited kiwifruit ripening caused the significant change of 69 proteomic spots of which the 29 where commonly regulated.

Στην παρούσα εργασία διαπιστώθηκε ότι η συντήρηση σε ατμόσφαιρα εμπλουτισμένη με όζον (0,3 μL L-1) παρεμπόδισε την παραγωγή του αιθυλενίου κατά την ωρίμανσή των ακτινιδίων μετά την έξοδο τους από τη ψυχρή συντήρηση. Το παραπάνω συσχετίστηκε με τη χαμηλή συσσώρευση του 1-αμινοκυκλοπροπάνιο-1-καρβοξυλικού οξέος (ACC) λόγω της μειωμένης δράσης του ενζύμου ΑCC συνθάση (ACS), ενώ η ανάλυση με RT-qPCR έδειξε ότι το όζον μειώνει την έκφραση του γονιδίου ACS1 που κωδικοποιεί την ACS. Οι καρποί που συντηρήθηκαν με όζον παρουσίασαν μειωμένο ρυθμό μαλακώματος, υψηλότερα επίπεδα αδιάλυτου στην αλκοόλη υπολείμματος (AIR) και μειωμένη διόγκωση του κυτταρικού τοιχώματος, διαλυτοποίηση της πηκτίνης και αποσύνθεση της ημικυτταρίνης κατά την ωρίμανσή τους. Επιπλέον το όζον μείωσε τη δράση των ενζύμων πολυγαλακτουρονάση (PG) και ενδο-1,4-β-γλουκανάση/1,4-β-γλυκοσιδάση (EGase/Glu) κατά την ωρίμανση των ακτινιδίων. Η πρώτη προσπάθεια ταυτοποίησης του πρωτεόματος του ακτινιδίου κατά την ωρίμανσή του μετά από συντήρηση σε ατμόσφαιρα εμπλουτισμένη με όζον πραγματοποιήθηκε με πρωτεομική ανάλυση που βασίστηκε στη χρήση της μονοδιάστατης ηλεκτροφόρησης με πηκτή πολυακρυλαμίδης σε μετουσιωτικές συνθήκες (1D-SDS-PAGE) και στη φασματομετρία μάζας. Η συγκεκριμένη ανάλυση επέτρεψε την ταυτοποίηση 102 πρωτεϊνών του ακτινιδίου, οι οποίες εμπλέκονται κυρίως στην ενέργεια, στο μεταβολισμό των πρωτεϊνών, στην άμυνα και στη δομή του κυττάρου. Η ωρίμανση των καρπών προκάλεσε την καρβονυλίωση (οξείδωση) των πρωτεϊνών όμως αυτή η επίδραση περιορίστηκε από τη μεταχείριση με όζον. Επιπρόσθετα, χαρακτηρίστηκαν 14 υποψήφιες για καρβονυλίωση πρωτεΐνες ακτινιδίου εκ των οποίων οι 4 έχουν αναφερθεί για αλλεργιογόνο δράση. Για την πληρέστερη κατανόηση του ρόλου του όζοντος στο μηχανισμό βιοσύνθεσης του αιθυλενίου πραγματοποιήθηκε εφαρμογή του 1-μεθυλκυκλοπροπενίου (1-ΜCP), ενώ αναπτύχθηκε πλατφόρμα πρωτεομικής ανάλυση βασισμένη στην τεχνική της δισδιάστατης ηλεκτροφόρισης με πηκτή πολυακρυλαμίδης σε μετουσιωτικές συνθήκες (2D-SDS-PAGE). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τόσο η συντήρηση σε όζον όσο και η μεταχείριση με 1-MCP παρεμπόδισαν την ενδογενή παραγωγή του αιθυλενίου κατά την ωρίμανση των καρπών στους 20 οC και καθυστέρησαν το μαλάκωμα της σάρκας σε σχέση με τους καρπούς του μάρτυρα. Ωστόσο, o συνδυασμός των δύο μεταχειρίσεων (1-MCP + Όζον) προκάλεσε ισχυρότερη παρεμπόδιση της ωρίμανσης των καρπών. Eπιπρόσθετα, διαπιστώθηκε ότι η παρεμπόδιση της παραγωγής του αιθυλενίου που προκαλείται από το όζον αναστέλλεται από το εξωγενές αιθυλένιο, καθώς οι καρποί ήταν σε θέση να βιοσυνθέτουν αυτοκαταλυτικά υψηλές ποσότητες αιθυλενίου αμέσως μετά την έκθεσή τους στο εξωγενές αιθυλένιο. Τα αποτελέσματα της πρωτεομικής ανάλυσης, έδειξαν ότι συγκριτικά με τον μάρτυρα, οι μεταχειρίσεις που πραγματοποιήθηκαν (1-MCP, Όζον, 1-MCP + Όζον) προκάλεσαν σημαντική μεταβολή σε 51 πρωτεϊνικές κηλίδες του πρωτεϊνικού χάρτη του ακτινιδίου, ενώ η μεταχείριση με εξωγενές αιθυλένιο προκάλεσε την μεταβολή σε 99 πρωτεϊνικές κηλίδες συνολικά σε όλες τις μεταχειρίσεις. Η τεχνική πρωτεομικής ανάλυσης 2D-SDS-PAGE χρησιμοποιήθηκε για τον χαρακτηρισμό των πρωτεϊνών του ακτινιδίου που ρυθμίζονται από το εξωγενές αιθυλένιο ή το ψύχος. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι και οι δύο μεταχειρίσεις προκάλεσαν την ωρίμανση των καρπών μετά από 10 d στους 20 οC, ενώ οι καρποί του μάρτυρα που δεν εκτέθηκαν στο ψύχος ωρίμασαν μετά από 20 d. Η πρωτεομική ανάλυση έδειξε ότι οι μεταχειρίσεις του εξωγενούς αιθυλενίου και του ψύχους μετέβαλαν 69 πρωτεϊνικές κηλίδες, εκ των οποίων οι 29 ήταν κοινές.