Γενετική μελέτη της έκφρασης του φύλου και της αυτοσυμβατότητας στη σποροφυτική επιλογή ακτινιδίου (cv. Tsechelidis) με χρήση κυτταρογενετικών και μοριακών μεθόδων

Abstract

All members of the Actinidia genus are functionally dioecious. Therefore, the development of stable hermaphrodite varieties of kiwifruit is thus a prime objective in breeding programs of Actinidia species. “Tsechelidis” is a new kiwifruit cultivar of Actinidia deliciosa species developed in North Greece. Despite its desirable characteristics, cv. “Tsechelidis” shows a certain degree of self-compatibility, as its female flowers produce viable pollen. The aim of the present research was to investigate the expression and nature of self-compatibility in “Tsechelidis” cultivar, by means of classical breeding and molecular methods. Controlled self-pollination of flowers was carried out to all selected vines of “Tsechelidis” and “Hayward” cultivar, for two growing seasons. At harvest stage, all fruits originated from self-pollinations were collected separately for further physicochemical analyses. Pollen viability was studied using the staining method of acetocarmine (1%). Based on the results of the self-pollination scheme and pollen viability test, selected vines of cv. “Tsechelidis” were classified under two main categories, of high and low degree of self-compatibility. Representative vines of those two main categories were selected for molecular analysis, using sex-linked SCAR and DEG markers. In addition, PCR products of the molecular analysis were sequenced, as an attempt to identify single nucleotide polymorphisms (SNP) between the genotypes of all 3 cultivars (Tsechelidis, Hayward and Matua). The results of the present study confirmed the expression of self-compatibility in cv. “Tsechelidis”, as it was proven that its female flowers produce viable pollen and vines can set fruit after self-pollination. Fruits of cv. “Tsechelidis”, originated from self-pollination, varied in shape and in size. Those fruits had also high quality of basic physicochemical parameters. Pollen viability results indicated that the age of vines might be an important factor in the expression of self-compatibility in cv. “Tsechelidis”. The sex-linked SCAR primers (SmX, SmY and SmY1) were proved accurate in identifying the sex of the genotypes tested and confirmed the female nature of cv. “Tsechelidis”. The sequencing of PCR products revealed many SNPs, in both sex-linked markers. By analysing the total number of SNPs detected, a general pattern was noticed, as “low-selfcompatible” genotypes of cv. “Tsechelidis” tended to have the same SNPs with the female genotypes of cv. “Hayward”, while “high-selfcompatible” ones showed common SNPs with the male genotypes of “Matua” cultivar. In addition, “low-compatible” genotypes of “Tsechelidis”, which are characterised by low rates of pollen viability, followed the SNP pattern of female “Hayward” genotypes, which are totally male-sterile. However, those are primary results, which require further investigation. Identification of sex genes in genus Actinidia and characterization of QTLs in the gender-linked area would help to acquire a better understanding of the expression of self-compatibility in “Tsechelidis” cultivar.

Όλα τα είδη του γένους Actinidia είναι δίοικα και για το λόγο αυτό απαιτείται στον αγρό η εγκατάσταση αρσενικών φυτών που χρησιμεύουν ως επικονιαστές. Εντούτοις, η διοικία δεν είναι απόλυτη κατάσταση στην ακτινιδιά, καθώς έχουν αναφερθεί περιπτώσεις αρσενικών πρεμνών που σχημάτισαν μικρούς καρπούς (fruiting males). Σκοπό της παρούσας εργασίας αποτέλεσε η μελέτη του φαινομένου της αυτοσυμβατότητας στο ακτινίδιο (A. deliciosa), με μοντέλο τη νέα ελληνική ποικιλία «Tsechelidis», η οποία εκτός από τα πολύ καλά χαρακτηριστικά απόδοσης και ποιότητας καρπών, παρουσιάζει ενδείξεις αυτοσυμβατότητας της γύρης των θηλυκών ανθέων της. Με στόχο να επιβεβαιωθεί η ύπαρξη του φαινομένου στην εν λόγω ποικιλία, αλλά και να διερευνηθεί ο βαθμός στον οποίο αυτό εκφράζεται, οργανώθηκε πείραμα σε τρεις αγρούς με διαφορετική σύνθεση επικονιαστών και πρέμνα διαφορετικής ηλικίας. Εφαρμόστηκαν συστηματικές αυτογονιμοποιήσεις τόσο σε άνθη της ποικιλίας «Tsechelidis», όσο και στην ποικιλία μάρτυρα «Hayward». Η βιωσιμότητα της γύρης ελέγχθηκε στο μικροσκόπιο, έπειτα από χρώση των ενεργών γυρεόκοκκων. Οι καρποί οι οποίοι προέκυψαν έπειτα από τις αυτογονιμοποιήσεις ανθέων, καθώς και καρποί ελεύθερης επικονίασης, υποβλήθηκαν σε περαιτέρω φυσικοχημικές αναλύσεις. Με βάση τα συγκεντρωτικά αποτελέσματα από τις αυτογονιμοποιήσεις ανθέων στον αγρό και τον έλεγχο βιωσιμότητας της γύρης στο εργαστήριο, έγινε χαρακτηρισμός των επιλεγμένων πρέμνων της ποικιλίας «Tsechelidis», ως προς το βαθμό αυτογονιμότητας που εκδήλωσαν. Από τις ακραίες κλάσεις (χαμηλής – υψηλής αυτογονιμότητας) της κατάταξης αυτής, επιλέχθηκαν συνολικά 18 γενότυποι, οι οποίοι υποβλήθηκαν στη συνέχεια σε περαιτέρω μοριακή ανάλυση. Για τη μοριακή ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν μοριακοί δείκτες τύπου SCAR, οι οποίοι συνδέονται με την έκφραση του φύλου στο ακτινίδιο. Τα προϊόντα της μοριακής ανάλυσης αλληλουχίθηκαν με σκοπό τον εντοπισμό πολυμορφισμών μεμονωμένων βάσεων (SNP). Από τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής έρευνας, προέκυψε ότι η ποικιλία «Tsechelidis» παρουσιάζει σημαντικά μεγαλύτερο βαθμό αυτοσυμβατότητας σε σχέση με την ποικιλία «Hayward». Τα άνθη της ποικιλίας «Tsechelidis» δύνανται να παράγουν γόνιμη γύρη. Η γύρη είναι αυτοσυμβατή, καθώς κατέστη δυνατή η παραγωγή καρπών έπειτα από αυτογονιμοποίηση. Οι καρποί που προήλθαν από αυτογονιμοποιήσεις ανθέων χαρακτηρίζονταν από μεγάλη παραλλακτικότητα ως προς το σχήμα και το μέγεθος τους. Ωστόσο, η φυσικοχημική ανάλυση των καρπών έδειξε ότι χαρακτηρίζονταν και από υψηλής ποιότητας φυσικοχημικές παραμέτρους. Η γενετική ανάλυση με τους μοριακούς δείκτες του φύλου επιβεβαίωσε τη θηλυκή φύση της ποικιλίας «Tsechelidis». Από τα αποτελέσματα της αλληλούχισης των προϊόντων της μοριακής ανάλυσης διαπιστώθηκε ότι οι γενότυποι της ποικιλίας «Tsechelidis», οι οποίοι χαρακτηρίζονταν από χαμηλή αυτογονιμότητα, εμφάνιζαν κατά κύριο λόγο κοινούς πολυμορφισμούς με τους γενότυπους της ποικιλίας «Hayward» και αντίστοιχα, οι γενότυποι της ποικιλίας «Tsechelidis», οι οποίοι χαρακτηρίζονταν από υψηλή αυτογονιμότητα, παρουσίαζαν κατά κανόνα κοινούς πολυμορφισμούς με τους γενότυπους της ποικιλίας «Matua». Η ολοκλήρωση της χαρτογράφησης του γονιδιώματος της ακτινιδιάς αναμένεται να βοηθήσει στην καλύτερη κατανόηση των μηχανισμών καθορισμού του φύλου.