Εξειδικευμένες φωσφατάσες και παράγοντες παθογένειας των βακτηρίων ως βιοδείκτες στη νόσο Alzheimer

Abstract

Environmental inorganic phosphorus constitutes the growth limiting nutrient for aquatic microorganisms. When starved for phosphate, bacteria adapt to their environment to increase their ability to take up inorganic phosphate. Example of an adaptation is the bacterial morphogenesis ending in the elaboration of long, filiform tubular extensions of the cell envelope of certain aquatic bacteria called stalks. Clinical isolates of P. aeruginosa formed stalks induced by phosphate limitation, which contain a DING protein named from the first 14 amino acids. This protein is an alkaline phosphatase. Bacteria, for motility and phosphate acquisition, develop also flagella, where the principal substituent is flagellin. They secrete also rhamnolipids which are glycolipids, bacterial metabolites that are produced by some bacteria mainly by Pseudomonas aeruginosa and their important role is that are “incriminated” as bacterial virulence factors. The formation of flagella is enhanced after prolonged cultivation time where phosphate and other nutrients were depleted; thus it seems likely that these organelles have a role in the virulence of pathogenic organisms. During the first part of this study we investigated and certified the co-localization of three components: DING protein, flagellin and rhamnolipids in stalks of T. thermophilus and the dependence of their production by the quantity of available phosphate. Ιn the second part we studied with various methods the existence of rhamnolipids in blood serum and their involvement in Alzheimer's disease, which can be caused by chronic bacterial infections. Increased levels of rhamnolipids in CSF of Alzheimer’s patients compared with control subjects raise the question whether rhamnolipids could be proposed as a potential prognostic factor for Alzheimer's disease. Furthermore, we studied the genotoxic, cytotoxic and cytostatic activity of rhamnolipids in human peripheral blood cells in vitro and their interaction with plasmid DNA. In the third and final part of the study the involvement of DING proteins in Alzheimer's disease was examined. Levels of DING proteins in CSF of Alzheimer’s patients appeared elevated compared to controls. Further experiments are needed to validate DING proteins as biomarkers of the disease. Finally, it was recorded DING proteins that contain the specific sequence DING and are implicated in AD disease.

Ο περιβαλλοντικός ανόργανος φώσφορος αποτελεί το περιοριστικό θρεπτικό συστατικό για την ανάπτυξη των υδρόβιων μικροοργανισμών. Όταν τα βακτήρια στερούνται τον φώσφορο, προσαρμόζονται στο περιβάλλον τους για να αυξήσουν την ικανότητά τους να προσλάβουν ανόργανα φωσφορικά άλατα. Παράδειγμα μιας τέτοιας προσαρμογής είναι η βακτηριακή μορφογένεση που καταλήγει σε μακριές, νηματοειδείς, σωληνοειδείς προεκτάσεις του κυτταρικού φακέλου ορισμένων υδρόβιων βακτηρίων που ονομάζονται μίσχοι (stalks). Κλινικά στελέχη της Ρ. aeruginosa σχηματίζουν μίσχους που επάγονται από περιορισμό φωσφορικών, οι οποίοι περιέχουν μια πρωτεΐνη που ονομάζεται DING από τα πρώτα 14 αμινοξέα. Αυτή η πρωτεΐνη είναι μια αλκαλική φωσφατάση. Τα βακτήρια, για να εξασφαλίσουν κινητικότητα και απόκτηση φωσφόρου, αναπτύσσουν και μαστίγια, όπου το κύριο συστατικό είναι η φλαζελίνη. Εκκρίνουν επίσης ραμνολιπίδια (RLs) που είναι γλυκολιπίδια, βακτηριακοί μεταβολίτες που παράγονται από ορισμένα βακτήρια, κυρίως από την Pseudomonas aeruginosa και ο σημαντικός ρόλος τους είναι ότι «ενοχοποιήθηκαν» ως βακτηριακοί παράγοντες παθογονικότητας. Ο σχηματισμός των μαστιγίων ενισχύεται ύστερα από παρατεταμένους χρόνους καλλιέργειας, οπότε τα φωσφορικά και άλλα θρεπτικά συστατικά εξαντλούνται. Έτσι, φαίνεται πιθανό ότι αυτά τα οργανίδια έχουν ένα ρόλο στη μολυσματικότητα των παθογόνων οργανισμών. Στο πρώτο λοιπόν μέρος της διατριβής μελετήθηκε και πιστοποιήθηκε στους μίσχους του T. thermophilus ο συνεντοπισμός των τριών συστατικών: της DING πρωτεΐνης, της φλαζελίνης και των ραμνολιπιδίων και η εξάρτηση της παραγωγής τους από τη διαθέσιμη ποσότητα φωσφορικών. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής διερευνήθηκε με διάφορες μεθόδους η ύπαρξη των ραμνολιπιδίων στον ορό του αίματος και μελετήθηκε η συμμετοχή τους στη νόσο του Alzheimer, η οποία μπορεί να προκληθεί από χρόνιες βακτηριακές λοιμώξεις. Αύξηση των επιπέδων των ραμνολιπιδίων στο ΕΝΥ ασθενών με Alzheimer σε σχέση με τα άτομα της ομάδας ελέγχου εγείρει το ερώτημα αν τα ραμνολιπίδια θα μπορούσαν να προταθούν ως ένας εν δυνάμει προγνωστικός παράγοντας για τη νόσο του Alzheimer. Επίσης, μελετήθηκε η γενοτοξική, κυτταροτοξική και κυτταροστατική δράση των ραμνολιπιδίων σε κύτταρα ανθρώπινου περιφερικού αίματος in vitro και η αλληλεπίδρασή τους με το πλασμιδιακό DNA. Στο τρίτο και τελευταίο μέρος της διατριβής εξετάστηκε η συμμετοχή των DING πρωτεϊνών στη νόσο Alzheimer. Τα επίπεδα των DING πρωτεϊνών στο ΕΝΥ ασθενών με Alzheimer εμφανίστηκαν αυξημένα σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Περαιτέρω πειράματα απαιτούνται για να επικυρωθούν οι DING πρωτεΐνες ως βιομάρτυρες της νόσου. Τέλος, έγινε καταγραφή των DING πρωτεϊνών που περιέχουν την ειδική αλληλουχία DING και εμπλέκονται στη νόσο AD.