Μελέτη της επίδρασης μεταλλοτοξινών στις νευροεκφυλιστικές διαδικασίες με έμφαση στη νόσο Alzheimer

Abstract

Alzheimer’s Disease (AD) is the most widespread mental degenerative condition of the human brain, whose incidence increases with age of the individual. It is a neurodegenerative disease with slow onset, leading to progressive weakening of cognitive functions, such as learning, memory, concentration ability and diathesis and human personality. Over the last decades, aluminium (Al) has been linked with numerous human pathological disorders, especially those associated with the onset of neurological diseases such as Alzheimer, microcytic anaemia, Pick’s disease, etc. To date, the potential (neuro)toxicity of aluminum (Al) and its correlation with the Alzheimer Disease aetiopathology has been under considerable debate. Therefore, aluminum bio-toxicity is a multifaceted subject of study and research aiming at the identification of the biochemical action and correlation of that neurotoxic metal ion biochemistry with pathological processes in Alzheimer disease. Various mechanisms have been proposed for Al-induced neurotoxicity, while the clinical picture of Alzheimer’s disease patients reveals the heavy Al(III) involvement in the formation intracellular neurofibrillary tangles and extracellular senile plaques, where Al(III) has been found at unusually high levels. In an effort to comprehend the role of that metal ion in neurodegenerative diseases, we investigated the potential biological activity of well-characterized Al(III) complex forms in neuronal and glial cellular environments. The undertaken effort constitutes a major research challenge to explore a) the potential correlation of the neurotoxic action of Al (III) on the neuronal function of N-methyl D-aspartate acid (NMDA) receptors and voltage-dependent calcium channels (VDCC), b) the biological activity of fully characterized physicochemical forms Al(III) in glial and neuronal cellular environments, c) the development of toxicity of the Aβ(1-40) peptide (known of rits neurotoxicity in Alzheimer’s disease) and its association with clearly defined complex bio-toxic aluminum forms, and d) the neuroprotective action of chelator agents, such as D-(-)-quinic acid (QA), Desferrioxamine mesylate salt (DFO) and Clioquinol (Clio), toward discrete complex Al(III) forms. In an attempt to shed light onto the role of this metallotoxin, extensive studies were carried out on the interaction of well-defined forms of Al(III) with neuronal membrane receptors and neuronal and glial cultures of neonate Sprague-Dawley rats. For the implementation of this study, fully physicochemically characterized crystalline complexes of aluminum were synthesized and isolated for further application at the biological level. The methods used to achieve the synthesis, isolation and characterization of pure crystalline Al(III) compounds with ligands, such as a) citric acid and D-(-)-quinic acid, which occur in biological fluids, and b) N-phosphono-methyl-imino-diacetic acid, which simulates biological substrates in aqueous solutions, involved advanced techniques (e.g. hydrothermal synthesis) and a plethora of physicochemical techniques (e.g. X-ray crystallography, FT-IR spectroscopy, elementary analysis, speciation, etc.). The six crystalline compounds of Al(III) used in the various experimental stages of this research were as follows: (1) Al(III) Atomic Absorption Standard (essentially AlCl3), (2) aluminum quinate, K[Al(C7H11O6)3].(OH).4H2O, (3) aluminum phosphonate, (CH6N3)4[Al2(C5­H6NPO7)2(OH)2].8H2O, (4) aluminum citrate 1, (ΝΗ4)5[Al(C6H4O7)2].2Η2Ο, (5) aluminum citrate 2, K4[Al(C6H4O7)(C6H5O7)].4H2O and (6) aluminum citrate 3, (NH4)5[Al3(C6H4O7)3(OH)(H2O)].(NO3).6H2O. At the biological level, in order to determine the in vitro effects resulting from acute, short-term, medium-term and long-term toxicity, appropriate dyes were applied for a direct imaging detection of intracellular calcium, synaptic degeneration, viability and cell mortality of hippocampal cells by using mainly Confocal Laser Scanning Microscopy. Worth noting in all cases was that a) the chemistry of each complex form of aluminum was directly related to the toxicity of the metal ion, the neuronal synaptogenesis loss and the neurodegenerative process, b) the degree of the metal ion Al(III) toxicity and the acidity of bio-toxic symptoms in the brain were determined by the nature and coordination chemistry of the ligand interacting with metal ion, c) the contribution of experimental conditions (nutrient media, pH, dose, exposure time) was noted in a wide variety of toxic actions of the metal ion, d) the neuronal cells were more susceptible to damage than glial cells, which showed lower vulnerability lesions induced by the metal ion, e) the Aβ amyloid peptide and well characterized forms of Al(III) interact. ...................................................................................................................

Η Νόσος Alzheimer (ΝΑ) αποτελεί την πιο διαδεδομένη μορφή νευροεκφύλισης του ανθρώπινου εγκεφάλου, της οποίας η συχνότητα εμφάνισης αυξάνεται με την ηλικία του ατόμου. Πρόκειται για μια νευροεκφυλιστική ασθένεια με βραδεία εκδήλωση, με αποτέλεσμα την προοδευτική εξασθένηση των νοητικών λειτουργιών, όπως η μάθηση, η μνήμη, η ικανότητα συγκέντρωσης αλλά και η διάθεση και η προσωπικότητα του ανθρώπου. Τα τελευταία χρόνια το αργίλιο (Al(III)) έχει συνδεθεί με ένα μεγάλο αριθμό φυσιολογικών διαταραχών του ανθρώπινου οργανισμού και ειδικότερα με την εμφάνιση ασθενειών στο νευρικό σύστημα, όπως η νόσος Alzheimer, η μικροκυτική αναιμία, η νόσος του Pick κ.ά. Η ανάδειξή του Al(III) σε περιβαλλοντική νευρομεταλλοτοξίνη αποδεικνύεται από α) τον ενισχυόμενο συσχετισμό με την ολοένα και αυξανόμενη βιοδιαθεσιμότητά του σε ζωντανούς οργανισμούς λόγω οξίνισης του περιβάλλοντος, και β) τη μεταβολική του εμπλοκή σε μη αντιστρεπτές βιοχημικές διεργασίες που οδηγούν στη νευροεκφύλιση. Μέχρι σήμερα, δεν είναι ξεκαθαρισμένη η ακριβής συσχέτιση του Al(III) με την αιτιοπαθογένεση της νόσου Alzheimer. Η παρουσία του, όμως, σε προσβληθέντα οργανίδια του ανθρώπινου εγκεφάλου σε ασυνήθιστα μεγάλες συγκεντρώσεις, στην περίπτωση ασθενών με νόσο Alzheimer, είναι αδιαμφισβήτητο γεγονός. Επομένως, η βιοτοξικότητα του Al(III) αποτελεί πολύπλευρο αντικείμενο μελέτης και έρευνας με στόχο την εξακρίβωση της βιοχημικής δράσης του και του συσχετισμού του με τα παθολογοανατομικά χαρακτηριστικά της νόσου Alzheimer και συγκεκριμένα με τις εξωκυτταρικές πλάκες γήρανσης και τα ενδοκυτταρικά νευροϊνιδώδη συμπλέγματα, όπου το Al(III) έχει εντοπιστεί σε υψηλά επίπεδα. Με βάση τα παραπάνω δεδομένα, το τοξικό δυναμικό και το συσχετισμό του Al(III) με τη NA, αναδύεται ως σημαντική ερευνητική πρόκληση η διερεύνηση α) της επίδρασης της βιοχημικής δράσης του Al(III) επί της λειτουργίας των υποδοχέων Ν-μεθυλο D-ασπαρτικού οξέος (NMDA) και των τασεοελεγχόμενων διαύλων ασβεστίου (VDCC) και της συσχέτισης με την νευροτοξικότητα του μεταλλοϊόντος Al(III), β) της βιολογικής δράσης φυσικοχημικά πλήρως χαρακτηρισμένων μορφών Al(III) στο κυτταρικό περιβάλλον νευρογλοιακών και νευρωνικών κυττάρων. Με τον τρόπο αυτό επιδιώκεται ο καθορισμός των παραγόντων εκείνων που επηρεάζουν τη βιοχημική δραστικότητα της νευροτοξίνης αυτής και συμβάλλουν στη διεργασία νευροεκφύλισης, γ) της συμπεριφοράς της τοξικότητας του Aβ(1-40) και της συσχέτισής του με σαφώς καθορισμένες μορφές βιοτοξικών ενώσεων του αργιλίου, και δ) της νευροπροστατευτικής δράσης χηλικών ενώσεων, όπως του D-(-)-κινικού οξέος, του Desferrioxamine mesylate salt (DFO) και του Clioquinol (Clio). Στην προσπάθεια διαλεύκανσης του ρόλου της μεταλλοτοξίνης αυτής, διεξήχθησαν εκτεταμένες μελέτες αλληλεπίδρασης καλά καθορισμένων μορφών του Al(III) με μεμβρανικούς νευρωνικούς υποδοχείς σε νευρωνικές και νευρογλοιακές καλλιέργειες νεογνών ποντικού Sprague-Dawley. Για την υλοποίηση της παρούσας μελέτης, ήταν απαραίτητο να επιδιωχθεί και επιτευχθεί η σύνθεση και απομόνωση διακριτών διαλυτών συμπλόκων μορφών του αργιλίου προς περαιτέρω χρήση τους σε βιολογικό επίπεδο. Οι μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν για να επιτευχθεί η σύνθεση, απομόνωση και ο χαρακτηρισμός των κρυσταλλικών υλικών από ενώσεις μετάλλων με ligands, όπως α)το κιτρικό οξύ και το D-(-)-κινικό οξύ που απαντώνται ή χρησιμοποιούνται σε βιολογικά υγρά και β) το Ν-φωσφονομεθυλο-ιμινοδιοξικό οξύ, που προσομοιάζει βιολογικά υποστρώματα μέσα σε υδατικά διαλύματα, περιλαμβάνουν πληθώρα προσεγγίσεων (π.χ. υδροθερμική) και φυσικοχημικών τεχνικών (κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ, φασματοσκοπία υπερύθρου FT-IR, στοιχειακή ανάλυση, υδατική ειδογένεση, κ.ά.). Οι έξι κρυσταλλικές ενώσεις του Al(III) που χρησιμοποιηθήκαν στην υλοποίηση της έρευνας αυτής ήταν οι εξής: (1) Al(III) Atomic Absorption Standard (AlCl3 ή Al-S), (2) Κινικό αργίλιο K[Al(C7H11O6)3].(OH).4H2O, (3) Φωσφονικό αργίλιο (CH6N3)4[Al2(C5­H6NPO7)2(OH)2].8H2O, (4) Κιτρικό αργίλιο 1 (ΝΗ4)5[Al(C6H4O7)2].2Η2Ο, (5) Κιτρικό αργίλιο 2 K4[Al(C6H4O7)(C6H5O7)].4H2O και (6) Κιτρικό αργίλιο 3 (NH4)5[Al3(C6H4O7)3(OH)(H2O)].(NO3).6H2O. ...........................................................................................................................