Η μεταβολομική ως υψηλής απόδοσης και πιστότητας πλατφόρμα βιομοριακής ανάλυσης για την αριστοποίηση της διαδικασίας παραγωγής θεραπευτικών πρωτεϊνών στη φαρμακοβιομηχανία

Abstract

The current work is a collaboration between Metabolic Engineering and Systems Biology laboratory at FORTH / ICE-HT and the pharmaceutical industry Bayer. Biopharmaceutical industry is directed to the production of therapeutic proteins with the use of mammalian cell cultures, as mammalian cells offer particular advantages on the quality of the final product. So, the study of mammalian cell culture physiology becomes very interesting. Additionally, the current cell culture monitoring toolbox in industry is less sensitive than desired. Only few prime variables are counted for the cell culture monitoring. For this reason, new and more sensitive methods that could enhance the current monitoring toolbox are under search. The study of the cell culture metabolism, the most directly responsive and dynamically changing level of the cellular function, is the purpose of the current study. With the dynamic analysis of the metabolic network using metabolomic analysis, multiple questions around the metabolic physiology of BHK (baby hamster kidney) mammalian cell cultures that are currently used in industry for the production of therapeutic proteins, have been answered. GC-MS metabolomic analysis on samples collected from Bayer ’s high cell density perfusion bioreactors, both laboratory and manufacturing – scale ones, was applied. Samples were, also, collected from cell cultures in shake flasks. In three experimental processes, several factors that affect, more or less, the cell culture metabolic physiology, were varied. These factors were: cell culture age, size of the bioreactor, pH, temperature, dissolved oxygen and medium composition of the cell culture. Metabolomic analysis provided answers about particular changes of the cell culture metabolic physiology and was proven powerful and sensitive tool for Cell Culture Engineering. Metabolic differences depended on the cell culture age are studied for the first time in detail. It is, also, shown the effect of perturbations in parameters affecting the cell culture environment on the cellular physiology and how much these perturbations differentiate the expected physiology. This is very important in industrial Cell Culture Engineering, and could define metabolomics as a validation tool for the consistency of cell culture physiology and process.

Η παρούσα εργασία αποτελεί μια συνεργασία μεταξύ του εργαστηρίου Μεταβολικής Μηχανικής και Συστημικής Βιολογίας στο ΙΤΕ / ΙΕΧΜΗ και της φαρμακοβιομηχανίας Bayer. Η φαρμακευτική βιομηχανία στρέφεται στην παραγωγή θεραπευτικών πρωτεϊνών με τη χρήση κυτταροκαλλιεργειών θηλαστικών, καθώς τα κύτταρα θηλαστικών παρέχουν συγκεκριμένα πλεονεκτήματα στην ποιότητα του τελικού προϊόντος. Αποκτά, λοιπόν, ιδιαίτερο ενδιαφέρον η μελέτη της φυσιολογίας των κυτταροκαλλιεργειών θηλαστικών. Επίσης, το υπάρχον σύστημα παρακολούθησης των κυτταροκαλλιεργειών στη βιομηχανία κρίνεται λιγότερο ευαίσθητο από το επιθυμητό. Μόνο λίγες πρωτογενείς μετρήσεις λαμβάνονται για την παρακολούθηση των κυτταροκαλλιεργειών. Για το λόγο αυτό αναζητούνται νέες μέθοδοι με μεγαλύτερη ευαισθησία, που θα μπορούσαν να ενισχύσουν την υπάρχουσα εργαλειοθήκη παρακολούθησης. Η μελέτη του μεταβολισμού της κυτταροκαλλιέργειας, του πιο άμεσα αποκρινόμενου και δυναμικά μεταβαλλόμενου επιπέδου της κυτταρικής λειτουργίας, είναι ο στόχος της παρούσας εργασίας. Με τη δυναμική ανάλυση του μεταβολικού δικτύου με χρήση μεταβολομικής ανάλυσης, απαντήθηκαν πολλαπλά ερωτήματα που αφορούσαν στη μεταβολική φυσιολογία κυτταροκαλλιεργειών BHK (baby hamster kidney - νεφρικά κύτταρα νεογνού χοιριδίου) που ήδη χρησιμοποιούνται στη φαρμακοβιομηχανία για την παραγωγή θεραπευτικών πρωτεϊνών. Έγινε χρήση GC-MS μεταβολομικής ανάλυσης σε δείγματα που συλλέχθηκαν από υψηλής κυτταρική πυκνότητας βιοαντιδραστήρες διαπότισης της Bayer, εργαστηριακής και βιομηχανικής κλίμακας. Δείγματα συλλέχθηκαν, επίσης, από κυτταροκαλλιέργειες σε φιάλες ανακίνησης. Σε τρεις πειραματικές διαδικασίες, διάφοροι παράγοντες διαφοροποιούνταν και επηρέαζαν, περισσότερο ή λιγότερο, τη φυσιολογία της κυτταροκαλλιέργειας. Τέτοιοι ήταν η ηλικία της κυτταροκαλλιέγειας, το μέγεθος του βιοαντιδραστήρα, το pH, η θερμοκρασία, το διαλυμένο οξυγόνο και το θρεπτικό μέσο της κυτταροκαλλιέργειας. Η μεταβολομική ανάλυση έδωσε απαντήσεις γύρω από συγκεκριμένες αλλαγές της μεταβολικής φυσιολογίας της κάθε κυτταροκαλλιέργειας και αποδείχτηκε ισχυρό και ευαίσθητο εργαλείο για την Μηχανική Κυτταροκαλλιεργειών. Μεταβολικές αλλαγές που οφείλονται στην ηλικία της κυτταροκαλλιέργειας, μελετώνται πρώτη φορά με τόση λεπτομέρεια. Δείχνεται, επίσης, η επίδραση των διαταραχών των παραγόντων που διαμορφώνουν το περιβάλλον της κυτταροκαλλιέργειας στη φυσιολογία των κυττάρων και κατά πόσο απομακρύνουν την κυτταροκαλλιέργεια από την αναμενόμενη φυσιολογία. Όλα τα παραπάνω είναι πολύ σημαντικά στη Μηχανική Κυτταροκαλλιεργειών και θα μπορούσαν να ορίσουν τη μεταβολομική σαν ένα εργαλείο επικύρωσης της φυσιολογίας της κυτταροκαλλιέργειας και της διαδικασίας.