Η επίδραση της πενίας άνθρακα στους κρυστάλλους οξαλικού ασβεστίου και στο μεταβολικό πρότυπο του Amaranthus sp. (κ.ν. βλήτο): μεταβολομική ανάλυση

Abstract

This thesis focuses on the study of calcium oxalate crystals formed in Amaranthus sp. in specialized cells called idioblasts. To-date there has been insufficient information in the literature about the actual role of the crystals in this plant physiology. In our group, the initial working hypothesis was that calcium oxalate crystals constitute dynamic systems which serve as carbon, rather than calcium, deposits in the plant. In my Master’s thesis this hypothesis was partially verified. It was confirmed that the crystals are indeed dynamic structures, and the carbon that participates in their formation is not derived from the ambient environment, but from other sources. In an effort to obtain a more extended perspective of the molecular physiology of the plants to understand the underlying mechanisms governing the formation and utilization of these crystals, a high-throughput biomolecular analysis approach, metabolomics, was applied. Metabolomic analysis provides a holistic perspective of the metabolic physiology of a biological system through the quantification and correlation analysis of the concentration profiles of the free small metabolites, which act as reactants and producs in the metabolic reactions, i.e. metabolic profiles. The metabolic profile of a system affects and is affected by the activity of the metabolic networks, thus provides a metabolic fingerprint of the biological system at a particular set of physiological conditions. In this context, a carbon starvation experiment was designed on a hydroponic system of the plant. Specifically, the control plants (to be called D1) were grown with zero ambient CO2 concentration in the rizosphere and normal concentration in the overground part, while the carbon starved plants (to be called D2) were grown with zero ambient CO2 concentration in both parts. Multivariate statistical analysis of the metabolic profiles indicated a significant difference in the metabolic physiology between the two treatments. Moreover, the metabolic network activity in D2 plants was negatively affected by carbon starvation. Specifically, the vast majority of the measured metabolites were of lower concentration, with the exception of few precursors of secondary metabolites. In addition, this metabolic phenotype was accompanied by a reduction of the calcium oxalate crystal volume. In a second time-series experiment, abscisic acid (ABA), the plant hormone characterized as a systemic alarm signal, was applied at a concentration of 100 μM through the petiole of cut leaves in order to cause stomatal closure. The experimental design hypothesis was based on the fact that stomatal closure (due to water limitation) causes carbon starvation within mesophyll tissues. Therefore, we wanted to investigate whether the observed decomposition of the calcium oxalate crystals under the adverse conditions might be the source of the necessary CO2 for the operation of the photosynthetic metabolism, minimizing the water loss. Indeed, after 6 hours of continuous treatment of the leaves with ABA, an almost complete degradation of the calcium oxalate crystals was observed. Moreover, the metabolic profiling analysis did not indicate significant differences in the metabolic physiology between the control and the ABA treated leaves. Finally, chlorophyll fluorescence measurements confirmed that the photosynthetic activity of the leaves is maintained at manageable levels, despite stomatal closure. Combined, the results of the experiment confirmed our initial working hypothesis that the calcium oxalate crystals can provide the substrate for the photosynthetic carbon fixation under adverse conditions. This function could be described as an "alarm” photosynthesis route and is vital for the survival of the plants under water stress conditions. Moreover, it enables the use of CO2 that is released through night respiration, thus avoiding carbon loss, while preventing the increase in the CO2 concentration at toxic levels inside the cells. Finally, it enables the supply of the leaves with inorganic carbon from the root and the soil, using the cells in which the calcium oxalate crystals are formed as an intermediate control node. It has to be noted that this is the first reported study establishing the role of calcium oxalate crystals as a special photosynthesis route.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή εστιάσαμε στην μελέτη των κρυστάλλων οξαλικού ασβεστίου που σχηματίζονται στο βλήτο (Amaranthus sp.) σε εξειδικευμένα κύτταρα τα οποία καλούνται ιδιοβλάστες. Δεδομένου ότι στη βιβλιογραφία δεν υπάρχουν επαρκή δεδομένα για το ρόλο των κρυστάλλων διατυπώθηκε υπόθεση εργασίας σύμφωνα με την οποία οι κρύσταλλοι πιθανόν να διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη διαχείριση του άνθρακα των φωτοσυνθετικών ιστών. H ίδια υπόθεση εργασίας είχε διατυπωθεί και για την εκπόνηση της μεταπτυχιακής μου διατριβής, η οποία επαληθεύτηκε εν μέρει: Οι κρύσταλλοι είναι δυναμικές δομές, ενώ ο άνθρακας ο οποίος λαμβάνει μέρος στο σχηματισμό των κρυστάλλων δεν προέρχεται από την ατμόσφαιρα αλλά από διαφορετικές πηγές. Λόγω αντικειμενικών δυσκολιών προσέγγισης του θέματος με κλασσικές μεθόδους Φυσιολογίας, επιλέχθηκε μια υψηλής απόδοσης μέθοδος, η μεταβολομική, που δίδει τη δυνατότητα για ακριβή και ταυτόχρονη μελέτη μεγάλου αριθμού μορίων, και της in vivo φυσιολογίας ενός βιολογικού συστήματος. Λαμβάνοντας υπόψη τα προηγούμενα αποτελέσματα πραγματοποιήθηκε πείραμα σε σύστημα υδροπονίας με δύο βασικούς χειρισμούς. 1) Φυτά-μάρτυρες (D1) στα οποία χορηγήθηκε αέρας μηδενικής συγκέντρωσης CO2 στη ρίζα και κανονικής συγκέντρωσης στο υπέργειο μέρος και 2) φυτά (D2) στα οποία χορηγήθηκε αέρας μηδενικής συγκέντρωσης CO2 στην ρίζα και στο υπέργειο μέρος με στόχο να αποκλειστεί πλήρως η τροφοδοσία CO2 προς τα φωτοσυνθετικά κύτταρα. Επισημαίνεται επίσης ότι σε παράλληλες αναλύσεις μεταβολομικής ανιχνεύθηκε οξαλικό οξύ και στον ανιόντα χυμό του βλαστού των πειραματόφυτων. Στο πείραμα που προαναφέρθηκε υπήρξε σαφής διαχωρισμός του μεταβολικού προφίλ των δύο χειρισμών, ενώ η πολυπαραγοντική στατιστική ανάλυση έδειξε ότι τα D2 φυτά καταπονούνται ισχυρά από την έλλειψη CO2 (πενία άνθρακα). Ολοι οι μεταβολίτες παρουσιάζουν σημαντική μείωση της συγκέντρωσής τους, με εξαίρεση ορισμένους μεταβολίτες κλειδιά οι οποίοι αποτελούν πρόδρομα μόρια μεταβολικών οδών του δευτερογενούς μεταβολισμού. Παράλληλα παρατηρήθηκε εμφανής μείωση του μεγέθους των κρυστάλλων. Συνθήκες “πενίας” άνθρακα, δημιουργούνται in planta όταν τα στομάτια παραμένουν κλειστά στη διάρκεια της ημέρας λόγω αντίξοων περιβαλλοντικών συνθηκών, συνεπώς η διάσπαση του οξαλικού ασβεστίου θα μπορούσε δυνητικά να προμηθεύσει το απαραίτητο CO2 για την απρόσκοπτη λειτουργία του κύκλου του Calvin, χωρίς να παραστεί ανάγκη ανοίγματος των στοματίων και συνεπώς να υπάρξει απώλεια νερού. Εάν αρθούν οι δυσμενείς συνθήκες, ή κατά τη διάρκεια της νύκτας όπου πλέον η φωτοσύνθεση δεν λειτουργεί, ξεκινά και η διαδικασία επαναδημιουργίας των κρυστάλλων. Δεδομένου ότι το κλείσιμο των στοματίων επάγεται από τη φυτορμόνη ΑΒΑ (που αποτελεί και ένα διασυστηματικό σήμα κινδύνου), έγινε εφαρμογή ΑΒΑ ώστε να διαπιστωθεί εάν στις συνθήκες αυτές η διάσπαση των κρυστάλλων θα μπορούσε να τροφοδοτήσει με CO2 το φωτοσυνθετικό μεταβολισμό. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η εφαρμογή ΑΒΑ σε αποκομένα φύλλα προκαλεί αποδόμηση των κρυστάλλων, ενώ δεν ανιχνεύεται οξαλικό οξύ στα δείγματα, ισχυρή ένδειξη το μόριο αυτό διασπάται. Επίσης δεν παρατηρούνται δραματικές μεταβολικές αλλαγές. Παράλληλες μετρήσεις φθορισμού χλωροφύλλης έδειξαν ότι η φωτοσυνθετική δραστηριότητα διατηρείται σε ανεκτά επίπεδα, παρά το κλείσιμο των στοματίων. Τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν την υπόθεση εργασίας για τη λειτουργία των κρυστάλλων οξαλικού ασβεστίου ως αποθεμάτων φωτοσυνθετικού άνθρακα. Η λειτουργία αυτή θα μπορούσε να χαρακτηριστεί ως «φωτοσύνθεση κινδύνου» η οποία επάγεται από το ΑΒΑ και είναι ζωτικής σημασίας για την επιβίωση σε συνθήκες έλλειψης νερού. Εκτός αυτού, η φωτοσύνθεση κινδύνου δίδει τη δυνατότητα ανάκτησης του CO2 το οποίο απελευθερώνεται μέσω της νυκτερινής αναπνοής (του υπέργειου, αλλά και του υπόγειου τμήματος του φυτού) και επομένως εξοικονομούνται σκελετοί άνθρακα. Αποτρέπει την άνοδο της συγκέντρωσης του CO2 σε τοξικά επίπεδα στα κύτταρα, τουλάχιστον στη διάρκεια της νύκτας, όταν τα στόματα παραμένουν κλειστά και δεν υπάρχει δυνατότητα φωτοσυνθετικής αφομοίωσης του εκλυόμενου αναπνευστικού CO2. Επίσης δίδει τη δυνατότητα τροφοδοσίας των φύλλων με ανόργανο άνθρακα από το υπόγειο τμήμα του φυτού ή από το έδαφος, με ενδιάμεσο σταθμό ελέγχου της διάθεσής του τα κύτταρα που σχηματίζουν τους κρυστάλλους. Αξίζει να σημειωθεί ότι το παρόν διδακτορικό αποτελεί πρώτη εμπεριστατωμένη προσπάθεια συσχέτισης του φυσιολογικού ρόλου κρυστάλλων οξαλικού ασβεστίου με την φωτοσυνθετική λειτουργία.