Προσδιορισμός διαφόρων ανοσοβιολογικών παραμέτρων σε φυσιολογικούς και αρθριτικούς επίμυς, με ή χωρίς αγωγή με δηλητήριο μέλισσας

Abstract

The a1-acid glycoprotein (AGP) is one of the major acute phase proteins that significantly increased during the acute phase response or in chronic inflammatory conditions such as experimental arthritis and thereby rheumatoid arthritis. The AGP is synthesized and secreted primarily by hepatocytes, while shown to be produced by myeloma cells and granulocytes from bone marrow. The AGP has immunomodulatory effect, characterized by both immunostimulation and immunosuppression mechanisms. In cases of an autoimmune disease its levels in serum are increased and they are indicative of the severity of the disease, increasing the concentration of AGP in the serum after systemic administration of pure AGP, leads to aggravation of symptoms of arthritis in arthritic rats, while the treatment with honey bee venom accompanied by the suppression of the disease.The purpose of this study is to identify various immunological parameters in normal and arthritic rats with or without treatment with honey bee venom, but also to investigate the possible role of AGP in the pathogenesis of arthritis in rats. The system of the dorsal air pouch resembles the arhtritic joint since a membrane is created which is similar and behaves as a barrier.So it can be used to investigate the local effect of AGP. We investigated the dorsal air pouch model to determine the effect of FCA and LPS in arthritic and normal rats and the determination of the acute phase proteins levels. We have found that the development of arthritis is accompanied by an increase in systemic synthesis of 45 kDa AGP. In synovial fluid and serum, and the cells isolated from the synovial fluid observed increased levels of AGP and AGP-positive cells respectively at 7, 14 and 21 days in AA rats. The HBV reduces the AGP levels in serum and synovial fluid and reduces the number of cells that produce it. Intracellular levels of AGP are due both to the ability of monocytes to produce and their ability to bind on the molecule of AGP. All these results could be considered to be indicators for the development of the arhtritis, but they are not directly related to the pathogenesis of the disease. The increased AGP levels in synovial fluid and intracellular (the cells of the hinge) probably related to local effects on the joint. The systemic formulation of 45 kDa AGP potential associated with the growth mechanism of AA while the local composition appears to be related to the inhibition of the growth mechanism of arthritis. From the results of the dorsal air pouch model, the AGP that was detected was possibly due to local production. Stimulation with LPS airlock resulting in a biphasic increase in levels of total-AGP maximized at 3, 1 and 24 hours after administration of LPS. Administration of FCA in the airlock leads to a gradual increase in the levels of AGP maximized at 24 hours post administration while the 70-90 kDa-AGP isoform observed 6-24 hours after the administration of the FCA. These results demonstrate differential synthesis of AGP isoforms in the airlock dependent of the microenvironment and the activating agents. In particular, the 70-90 kDa-AGP which was only detected in exudate, is potential to play a key role in local joint. Possibly, the different isoforms of AGP shown to the airlock mode,l may be due to different glycosylation of molecules produced locally by tissue cells in the airlock or polymorphonuclear cells from the exudate. The results of this study also show that there is no direct correlation between the accumulation of AGP and IL-1b and IL-6 in the air pouch exudate which had been administered with LPS, where the AGP is produced earlier than these cytokines. Thus there is a possibility for the AGP to participate to the induction of these cytokines in the airlock and may be responsible for the activation of PMN cells in the airlock that they produce and secrete IL-6. On further investigation, we found an increased number of positive cells in IL-6 only in the case of co-culture of cells with exudate cells forming the airlock, mainly macrophages and fibroblasts. This fact indicates that the 40-45 kDa AGP likely to be the isoform that increases the production of IL-6 by the cells of the exudate. Topical administration of FCA in the airlock triggers the local production and composition of the various isoforms of AGP. Moreover, the initial reduction in serum albumin levels should be associated with mechanisms involving the passive transfer of components and cell migration in the airlock while the significant increase in the levels of chronic inflammation should be associated with aid of barrier in the airlock and removing components in suspension and cells. Also studied the differential activation of isoforms of nuclear proteins C / EBP α and C / EBP β between liver samples and membrane airlock samples. They possibly play a key role in regulating the AGP gene topically in the dorsal air pouch membrane and possibly at the joint. The pattern of the AGP levels in serum and synovial fluid in arthritic rats airlock, appears similar to that of the normal animals which have been treated with FCA in the airlock. This shows how important is the tool of the dorsal air pouch model to study the course and progression of the disease of arthritis, and a similar articulation. Summarizing all of the above data this study shows the importance of AGP and other biological factors examined in the development and pathophysiology of AA, while perceived both generalized and local potential involvement in the joint and confirmed data that indicate similarity between the hinge and the dorsal air pouch model and make this model a valuable tool in the study of chronic diseases such as rheumatoid arthritis.

Η α1-όξινη γλυκοπρωτεΐνη (AGP) αποτελεί μια από τις βασικότερες πρωτεΐνες οξείας φάσης και αυξάνεται σημαντικά κατά τη διάρκεια της απόκρισης οξείας φάσης ή σε χρόνιες φλεγμονώδεις καταστάσεις, όπως είναι η πειραματική αρθρίτιδα και κατ’ επέκταση η ρευματοειδής αρθρίτιδα. Η AGP συντίθεται και εκκρίνεται κυρίως από τα ηπατοκύτταρα, ενώ έχει δειχθεί ότι παράγεται και από μυελοκύτταρα όσο και από κοκκιοκύτταρα του μυελού των οστών. Η AGP παρουσιάζει ανοσοτροποποιητική δράση που χαρακτηρίζεται τόσο από μηχανισμούς ανοσοδιέγερσης όσο και από μηχανισμούς ανοσοκαταστολής. Στις περιπτώσεις των αυτοανοσονόσων τα επίπεδά της στον ορό αυξάνονται και είναι ενδεικτικά της σοβαρότητας της νόσου. Η αύξηση της συγκέντρωσης της AGP στον ορό έπειτα από συστεμική χορήγηση καθαρής AGP οδηγεί σε επιδείνωση των συμπτωμάτων της αρθρίτιδας σε αρθριτικούς επίμυς, ενώ η αγωγή με δηλητήριο της μέλισσας, συνοδεύεται από καταστολή της νόσου. Σκοπός της Διδακτορικής αυτής Διατριβής είναι ο προσδιορισμός διαφόρων ανοσοβιολογικών παραμέτρων σε φυσιολογικούς και αρθριτικούς επίμυς με ή χωρίς αγωγή με δηλητήριο μέλισσας, αλλά και η διερεύνηση του πιθανού ρόλου της AGP στον μηχανισμό παθογένειας της αρθρίτιδας στους επίμυς. Επίσης, με δεδομένο ότι το σύστημα του ραχιαίου αεροθύλακα προσομοιάζει την άρθρωση αφού δημιουργείται μία μεμβράνη παρόμοια με την αρθρική που συμπεριφέρεται ως φραγμός και μπορεί να χρησιμοποιηθεί προκειμένου να διερευνηθεί η τοπική δράση της AGP. Tο μοντέλο του ραχιαίου αεροθύλακα χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της επίδρασης του FCA και του LPS στον αεροθύλακα των αρθριτικών και φυσιολογικών επίμυων όσων αφορά τον προσδιορισμό των επιπέδων των πρωτεϊνών οξείας φάσης. Βρέθηκε λοιπόν, ότι η ανάπτυξη αρθρίτιδας συνοδεύεται με αύξηση στη συστεμική σύνθεση της 45 kDa AGP. Στο αρθρικό υγρό και τον ορό, όσο και στα κύτταρα που απομονώθηκαν από το αρθρικό υγρό παρατηρείται αύξηση των επιπέδων της AGP και των θετικών για AGP κυττάρων αντίστοιχα στις 7, 14 και 21 ημέρες στους ΑΑ επίμυς. Το HBV ελαττώνει τα επίπεδα της AGP στον ορό και το αρθρικό υγρό και μειώνει τον αριθμό των κυττάρων που την παράγουν. Τα ενδοκυτταρικά επίπεδα της AGP οφείλονται τόσο στην ικανότητα των μονοκυττάρων να την παράγουν όσο και στην ικανότητά τους να τη δεσμεύουν. Όλα τα παραπάνω αποτελέσματα θα μπορούσαν να θεωρηθούν δείκτες ανάπτυξης αρθρίτιδας, χωρίς όμως να σχετίζονται άμεσα με την παθογένεια της ασθένειας. Τα αυξημένα επίπεδα της AGP στο αρθρικό υγρό και ενδοκυτταρικά (στα κύτταρα της άρθρωσης) πιθανό να σχετίζονται με τοπικές δράσεις επάνω στην άρθρωση. Η συστεμική σύνθεση της 45 kDa AGP πιθανά να σχετίζεται με το μηχανισμό ανάπτυξης της ΑΑ ενώ η τοπική της σύνθεση φαίνεται να σχετίζεται με την παρεμπόδιση του μηχανισμού ανάπτυξης αρθρίτιδας. Από τη διερεύνηση του μοντέλου του ραχιαίου αεροθύλακα η AGP που ανιχνεύεται πιθανά οφείλεται σε τοπική παραγωγή. Η διέγερση του αεροθύλακα με LPS έχει ως αποτέλεσμα τη διφασική αύξηση των επιπέδων της συνολικής-AGP που μεγιστοποιείται στις 1-3 και στις 24 ώρες μετά τη χορήγηση του LPS. Η χορήγηση FCA στον αεροθύλακα οδηγεί σε σταδιακή αύξηση των επιπέδων της AGP που μεγιστοποιείται στις 24 ώρες μετά τη χορήγηση ενώ η 70-90 kDa- AGP ισομορφή παρατηρείται 6-24 ώρες μετά τη χορήγηση του FCA. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν διαφορική σύνθεση των ισομορφών της AGP αεροθύλακα που εξαρτάται από το μικροπεριβάλλον του και τον παράγοντα ενεργοποίησής του. Ειδικότερα η 70-90 kDa-AGP η οποία ανιχνεύθηκε μόνο στο εξίδρωμα πιθανά να παίζει καθοριστικό ρόλο τοπικά στην άρθρωση. Ενδεχομένως, οι διαφορετικές ισομορφές της AGP που εμφανίζονται στο μοντέλο του αεροθύλακα να οφείλονται σε διαφορετική γλυκοσυλίωση των μορίων που παράγονται τοπικά από κύτταρα του ιστού του αεροθύλακα ή από το πολυμορφοπύρηνα κύτταρα του εξιδρώματος. Τα αποτελέσματα της διατριβής δείχνουν επίσης, ότι δεν υπάρχει άμεση συσχέτιση μεταξύ της συσσώρευσης της AGP και της IL-1β ή IL-6 στο εξίδρωμα αεροθύλακα όπου είχε χορηγηθεί LPS, εφόσον η AGP παράγεται νωρίτερα από αυτές τις κυτοκίνες επομένως, η AGP πιθανά να συμμετέχει στην επαγωγή των κυτοκινών αυτών στον αεροθύλακα και ενδεχομένως να είναι υπεύθυνη για την ενεργοποίηση των PMN κυττάρων του αεροθύλακα ώστε αυτά να παράγουν και να εκκρίνουν IL-6. Με περεταίρω διερεύνηση, βρέθηκε αυξημένος αριθμός κυττάρων θετικών στην IL-6 μόνο στην περίπτωση συνκαλλιέργειας των κυττάρων του εξιδρώματος με κύτταρα που σχηματίζουν τον αεροθύλακα, κυρίως μακροφάγα και ινοβλάστες. Το γεγονός αυτό δείχνει ότι η 40-45 kDa AGP πιθανά να είναι η ισομορφή που αυξάνει την παραγωγή της IL-6 από τα κύτταρα του εξιδρώματος. Η τοπική χορήγηση του FCA στον αεροθύλακα ενεργοποιεί την τοπική παραγωγή και σύνθεση των διαφόρων ισομορφών της AGP. Επιπλέον, η αρχική μείωση των επιπέδων της αλβουμίνης θα πρέπει να σχετίζεται με μηχανισμούς που αφορούν την παθητική μεταφορά συστατικών και τη μετανάστευση κυττάρων στον αεροθύλακα ενώ αντίθετα η σημαντική αύξηση των επιπέδων της στη χρόνια φλεγμονή θα πρέπει να σχετίζεται με ενίσχυση του φραγμού του αεροθύλακα και την αναστολή στην απομάκρυνση συστατικών και κυττάρων. Επίσης, διερευνήθηκε και η διαφορική ενεργοποίηση των ισομορφών των πυρηνικών πρωτεϊνών C/EBPα και C/EBPβ ανάμεσα στα δείγματα ήπατος και μεμβράνης αεροθύλακα που πιθανά παίζουν καθοριστικό ρόλο στη ρύθμιση του γονιδίου της AGP τοπικά στη μεμβράνη του ραχιαίου αεροθύλακα και ενδεχομένως και στην άρθρωση. Το πρότυπο της AGP στον ορό και το αρθρικό υγρό στους αρθριτικούς επίμυες με αεροθύλακα εμφανίζεται παρόμοιο με αυτό των φυσιολογικών πειραματοζώων στα οποία έχει χορηγηθεί FCA στον αεροθύλακα. Το γεγονός αυτό φανερώνει πόσο σημαντικό εργαλείο αποτελεί το μοντέλο του ραχιαίου αεροθύλακα στη μελέτη της πορείας και της εξέλιξης της ασθένειας της αρθρίτιδας, μια και προσομοιάζει στην άρθρωση. Ανακεφαλαιώνοντας και με βάση όλα τα παραπάνω δεδομένα φαίνεται η σημασία της AGP και των υπολοίπων βιολογικών παραγόντων που εξετάστηκαν στην πορεία ανάπτυξης και την παθοφυσιολογία της ΑΑ, ενώ αναδεικνύεται τόσο η γενικευμένη όσο και η τοπική πιθανή ανάμειξή της στην άρθρωση και επιβεβαιώνονται τα στοιχεία που φανερώνουν ομοιότητα ανάμεσα στην άρθρωση και το μοντέλο του ραχιαίου αεροθύλακα και το καθιστούν πολύτιμο εργαλείο στη μελέτη χρόνιων ασθενειών όπως η Ρευματοειδής Αρθρίτιδα.