Εφαρμογές χρωματογραφίας hplc στον προσδιορισμό φαρμακευτικών ουσιών και συστατικών τροφίμων με εξατμιστικό ανιχνευτή σκέδασης ακτινοβολίας

Abstract

In this Doctoral Thesis a study was carried out to examine the field of applications of Evaporative Light Scattering Detector in HPLC systems in food and pharmaceutical Analysis. In food analysis , carbohydrates in honeys and oil triglycerides profile were examined and in pharmaceutical analysis , the determination of clarithromycin was carried out. ELSD is a quasi-universal detector suitable for the determination of a number of analytes. The main steps of the detector operation are: a. The eluent from the HPLC column is nebulized into a fine mist of droplets; b. The mobile phase solvent is evaporized using a heated evaporation (drift) tube, at a low temperature; c. The remaining solute molecules, assisted by gas supported focusing (GSF), pass through an optical beam and light scattering is measured. Although this type of detection is related to the scattering mechanism, for a number of applications the chromatographic peak area can be related to the concentration of the analytes. One of the main advantages of the use of ELSD detection is its ability for quantification of the analyte without the time consuming sample treatment or derivatisation step. Both procedures are common for the most used UV-vis detectors. For the chromatographic determination of sugars in honey, fructose, glucose, sucrose and maltose were determined with reversed phase HPLC. The mobile phase used consisted of time gradient of acetonitrile/water with initial ratio 90/10 % v/v to final ratio 82,5/17,5 % v/v. Sugars solutions were prepared with proper dissolution in water. Calibration curves were linear with a range of 6-600 mg/L, the detection limits being 2.64 mg/L for fructose, 2.17 for glucose, 1.90 mg/L for sucrose and 1.82 mg/L for maltose. The method developed was applied for the determination of the aforementioned sugars in honey samples. The samples were injected in the chromatographic system, after dissolution in water. The sugar content was calculated using standard additions plot or the normalization procedure of the areas of the chromatographic peaks. This method was also utilized for the determination of adulteration in honeys with sucrose. For the quality examination of olive oils a reversed phase HPLC chromatographic system with a time gradient mobile phase of acetonitrile/ water was developed. The oils under examination were injected to the chromatographic system simply after proper dilution with acetone, which renders this method especially fast and simple. The triglyceride peaks were identified using reference 238 chromatograms obtained in the same conditions (column, mobile phase). The data obtained were subjected to principal component analysis (PCA). From the results of the training and control sets of oils it was revealed that there was a significant trend of grouping of the olive oils compared to other seed oils. This behavior can be used for the adulteration control in olive oils, because the adulterated olive oils appeared as outliers in the PCA plot. Further to this adulterated olive oils showed a significant increase of some characteristic chromatographic peaks, such as ECN 42. In the field of pharmaceutical analysis, ELS-Detector was used for the first time for the development of an HPLC method for the determination of the macrolide antibiotic clarithromycin. Isocratic reversed phase HPLC approach was developed using a C-18 column (Waters Spherisorb 5 μm ODS2, 4.6x250 mm) and a mobile phase consisted of acetonitrile / aqueous trifluoroacetic acid, and formic acid as pairing reagents. Experimental parameters (temperature of heated drift tube, flow rate of mobile phase, gas flow rate, mobile phase composition) were optimized. Using the optimized conditions the working range was 10-100 mg/L (upper limit can be increased considerably), with a detection limit of 4.5 mg/L (6x10-6 M). The retention time is 4.7 min. The method was successfully applied for the content assay of clarithromycin formulations.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή διερευνάται το πεδίο εφαρμογών του Εξατμιστικού Ανιχνευτή Σκέδασης Ακτινοβολίας (ELSD) ως ανιχνευτή σε χρωματογραφικά συστήματα HPLC. Τα πεδία εφαρμογών που μελετήθηκαν ήταν, στον τομέα της ανάλυσης τροφίμων ο προσδιορισμός υδατανθράκων σε μέλια και η μελέτη του χρωματογραφικού προφίλ ελαιολάδων και φυτικών ελαίων, ενώ στον τομέα της φαρμακευτικής ανάλυσης ο προσδιορισμός του μακρολίδιου αντιβιοτικού κλαριθρομυκίνης. Ο ELSD είναι ημιγενικός ανιχνευτής συμβατός με χρωματογραφικά συστήματα HPLC, η αρχή λειτουργίας του οποίου βασίζεται στην εκνέφωση του εκλούσματος, όπως αυτό εξέρχεται από την αναλυτική στήλη, στην εξάτμιση των συστατικών της κινητής φάσης και κατόπιν τη μέτρηση της σκεδαζόμενης ακτινοβολίας από τα σωματίδια του αναλύτη που δεν έχουν εξατμιστεί. Παρόλο που η ως άνω περιγραφόμενη απόκριση του ανιχνευτή εξαρτάται από το μηχανισμό σκέδασης, για ένα μεγάλο πεδίο εφαρμογών το εμβαδόν των χρωματογραφικών κορυφών μπορεί να συσχετιστεί με τη συγκέντρωση μάζας του αναλύτη. Σημαντικό πλεονέκτημα του ELSD αποτελεί η ικανότητά του για την ποσοτικοποίηση ουσιών, χωρίς να απαιτείται προκατεργασία του δείγματος ή και σε πολλές περιπτώσεις παραγωγοποίηση, μειονεκτήματα ιδιαίτερα διαδεδομένα στους ευρύτατα χρησιμοποιούμενους ανιχνευτές υπεριώδους-ορατού (UV-vis). Κατά το χρωματογραφικό προσδιορισμό σακχάρων στο μέλι, εξετάστηκαν τα σάκχαρα φρουκτόζη, γλυκόζη, σακχαρόζη και μαλτόζη με χρωματογραφία αντιστρόφου φάσεως. Η κινητή φάση που χρησιμοποιήθηκε αποτελείται από ακετονιτρίλίο / νερό με αρχική αναλογία 90/10 % v/v, η οποία μεταβάλλεται χρονικά σε 82,5/17,5 % v/v. Τα διαλύματα των σακχάρων παρασκευάζονται σε νερό. Τα διαγράμματα βαθμονόμησης των σακχάρων είναι γραμμικά με εύρος συγκεντρώσεων 6-600 mg/L, ενώ τα όρια ανίχνευσης τους είναι 2,64 mg/L για τη φρουκτόζη, 2,17 mg/L για τη γλυκόζη, 1,90 mg/L για τη σακχαρόζη και 1,82 mg/L για τη μαλτόζη. Η αναπτυχθείσα μέθοδος εφαρμόστηκε για τον προσδιορισμό των προαναφερθέντων σακχάρων σε δείγματα μελιών τα οποία εισάγονται στο χρωματογραφικό σύστημα κατόπιν απλής διαλυτοποίησης σε νερό. Η περιεκτικότητα των σακχάρων υπολογίστηκε, είτε με χρήση διαγραμμάτων γνωστών προσθηκών, είτε με τη μέθοδο της κανονικοποιήσεως των