The role of inhibition in behavior and physiology of mouse cerebral cortex

Abstract

The prefrontal cortex (PFC) is involved in higher-order cognitive functions (short-term and long-term mnemonic functions) as well as in emotional processes. Although age seems to play a significant role in both the normal function of PFC and the emergence of disease states, very little is known with regards to the age-dependent changes of behaviors involving the PFC and the underlying cellular mechanisms. Previous studies, primarily based on dendritic morphology, have suggested that this higher-order brain region exhibits delayed cortical development compared to primary sensory cortical areas that lasts until young adulthood. Investigating the PFC postnatal development is critical to radically improve our understanding of brain function and behavior as well as of the emergence substrate of devastating neuropsychiatric disorders involving the PFC. The PFC, similar to other cortical areas, is composed of glutamatergic excitatory neurons and GABAergic inhibitory interneurons. A balance between these two systems is required for proper functioning of the PFC. Recently, the role of the GABAergic system has strongly been implicated in contributing to possible imbalances between the two main systems, ultimately leading to pathological states. Our goal in this dissertation was two-fold. Firstly, we aimed to better understand the postnatal development of the PFC and secondly, to study changes in PFC behavior and underlying cellular mechanisms in cases with reduced GABAergic inhibition. Our results are presented in three different chapters. In Chapter I, we used a multidisciplinary approach including cellular, electrophysiological and behavioral techniques in different age groups of mice in order to better understand the PFC development. In many cases, a comparison to other cortical areas was made. We find a differential expression of distinct types of dendritic spines in pyramidal neurons of PFC between different age groups of mice. In particular, ‘adolescent’ pyramidal neurons (40 days old) exhibit the lowest spine density measured, with an increased percentage of stubby spines, while the ‘juvenile’ (35 days old) and ‘young adult’ pyramidal neurons (60 days old) have increased number of spines, and particularly of the mushroom type. This developmental pattern was also observed in our electrophysiological studies, in which the ‘juvenile’ and ‘young adult’ age groups exhibit increased long-term potentiation (LTP) of synaptic transmission in response to tetanic stimulation, while the ‘adolescent’ age group exhibits decreased LTP. Finally, ‘adolescent’ mice perform poorer in PFC-dependent tasks, such as the delayed alternation in the T-maze and the temporal order object recognition task, without exhibiting differences in non-PFC-dependent tasks, such as the novel object and objet-to-place recognition tasks, compared to young adult mice. In Chapter II, we studied the role of decreased inhibition in PFC physiology and in mouse behavior, using the Rac1 conditional transgenic mouse (Rac1 cKO) that displays ~50% less cortical interneurons due to the loss of the Rac1 protein from Nkx2.1-expressing cells. We find that the adult Rac1 cKO exhibit increased susceptibility to pharmacological-induced epileptic seizures as well as increased anxiety. At the cellular level, Rac1 cKO mice exhibit impaired short-term plasticity and LTP in response to tetanic stimulation within the PFC. Changes in dendritic morphology, such as reduced mushroom-type spines and reduced dendritic length, could underlie the decrease in LTP of the Rac1 cKO mice. In Rac1 cKO brain slices, up-regulation of GABA-receptor-mediated neurotransmission using a mild dose of diazepam was sufficient to rescue the impaired LTP. The above findings led us to further hypothesize that the PFC network of Rac1 cKO mice exhibit an imbalance of excitation and inhibition, caused by deregulation of the glutamatergic system in response to functional reductions of the GABAergic system, which ultimately result in increased anxiety and vulnerability to epileptic seizures. We also studied the juvenile Rac1 cKO mice, which exhibit decreased anxiety and increased LTP induction after tetanic stimulation with an underling increase in the number of dendritic spines compared to juvenile Rac1 Het (heterozygous) mice, used as control. Finally, acute or chronic inhibition of the GABAergic system in Rac1 Het mice with picrotoxin also impaired the LTP in the PFC. Our results suggest that proper inhibition during the juvenile period is critical for the normal development of synaptic properties and plasticity within layer II of PFC, as well as for the development of the normal behavior and cognitive functions. In Chapter III, we undertook a computational approach to study how reductions in GABAergic inhibition in a PFC microcircuit model affect the properties of persistent activity, considered the cellular correlate of working memory function in PFC. To this end, we constructed a PFC microcircuit, consisting of pyramidal neuron models and all three different types of interneurons: fast-spiking (FS), regular-spiking (RS), and irregular-spiking (IS) interneurons. Persistent activity was induced in the microcircuit model and its properties were analyzed. Removing or decreasing the FS model input to the pyramidal neuron models greatly limited the biophysical modulation of persistent activity induction, decreased the ISIs (inter-spike intervals), neuronal synchronicity and gamma-power oscillations during persistent activity. The effect on synchronicity and oscillations could be reversed by the addition of other inhibitory inputs to the soma, but beyond the levels of the control network. Thus, generic somatic inhibition acts as a pacemaker of persistent activity and FS specific inhibition modulates the output of the pacemaker.Overall, our results contributed to the growing knowledge on PFC functions during development and their underlying mechanisms that render the PFC “the region that humans prize for its ability to regulate our thoughts and behaviors”.

Ο προμετωπιαίος φλοιός συμμετέχει σε ανώτερες γνωσιακές λειτουργίες (λειτουργίες βραχύχρονης και μακρόχρονης μνήμης) αλλά και σε συναισθηματικές λειτουργίες. Αν και η ηλικία φαίνεται να παίζει πολύ σημαντικό ρόλο και στην φυσιολογική λειτουργία του προμετωπιαίου φλοιού αλλά και στην εμφάνιση ασθενειών, λίγα είναι γνωστά για τις ηλικιο-εξαρτώμενες αλλαγές των συμπεριφορών όπου συμμετέχει ο προμετωπιαίος φλοιός αλλά και για τους υποκείμενους κυτταρικούς μηχανισμούς. Προηγούμενες μελέτες, κυρίως βασιζόμενες στην μορφολογία των δενδριτών, έχουν προτείνει ότι αυτή η ανώτερης-τάξης εγκεφαλική περιοχή παρουσιάζει καθυστερημένη ανάπτυξη, συγκρινόμενη με πρωτοταγείς αισθητικές φλοιϊκές περιοχές, η οποία διαρκεί μέχρι και την πρώιμη ενηλικίωση. Η κατανόηση της μεταγεννητικής ανάπτυξης του προμετωπιαίου φλοιού είναι κρίσιμη προκειμένου να βελτιώσουμε ριζικά την κατανόηση της εγκεφαλικής λειτουργίας και της συμπεριφοράς όσο και το υπόστρωμα εκκίνησης ολέθριων νευροψυχιατρικών διαταραχών στης οποίες συμμετέχει ο προμετωπιαίος φλοιός. Ο προμετωπιαίος φλοιός, παρόμοια με άλλες περιοχές του φλοιού, αποτελείται από γλουταματεργικούς διεγερτικούς νευρώνες και GABAεργικούς ανασταλτικούς διάμεσους νευρώνες. Η ισορροπία μεταξύ αυτών των δύο συστημάτων απαιτείται για την ορθή λειτουργία του προμετωπιαίου φλοιού. Πρόσφατα, ο ρόλος του GABAεργικού συστήματος συσχετίστηκε έντονα με πιθανή ανισορροπία μεταξύ των δύο συστημάτων, που τελικά οδηγεί σε παθολογικές καταστάσεις. Ο στόχος μας σε αυτή τη διατριβή ήταν διπλός. Αρχικά, θελήσαμε να κατανοήσουμε καλύτερα την μεταγεννητική ανάπτυξη του προμετωπιαίου φλοιού και δεύτερον, να μελετήσουμε της αλλαγές στην συμπεριφορά του προμετωπιαίου φλοιού και στους υποκείμενους κυτταρικούς μηχανισμούς σε περιπτώσεις μειωμένης GABAεργικής αναστολής. Τα αποτελέσματα μας παρουσιάζονται σε τρία κεφάλαια. Στο κεφάλαιο Ι, χρησιμοποιήσαμε μία διεπιστημονική προσέγγιση που περιελάμβανε κυτταρικές, ηλεκτροφυσιολογικές και συμπεριφορικές τεχνικές σε διαφορετικές ηλικιακές ομάδες μυών για να κατανοήσουμε καλύτερα την ανάπτυξη του προμετωπιαίου φλοιού. Σε πολλές περιπτώσεις, πραγματοποιήθηκε και η σύγκριση με άλλες φλοιϊκές περιοχές. Διαπιστώνουμε μία διαφορετική έκφραση των διάφορων τύπων δενδριτικών ακάνθων σε πυραμιδικούς νευρώνες του προμετωπιαίου φλοιού μεταξύ των μυών που ανήκουν σε διαφορετικές ηλικιακές ομάδες. Συγκεκριμένα, οι «έφηβοι» πυραμιδικοί νευρώνες (ηλικίας 40 ημερών) παρουσιάζουν την μικρότερη πυκνότητα ακάνθων, με αυξημένο ποσοστό κοντόχοντρων (stubby) ακάνθων, ενώ στις ομάδες των «νεαρών» (ηλικίας 35 ημερών) και «πρώιμων ενήλικων» (ηλικίας 60 ημερών) πυραμιδικών νευρώνων παρουσιάζεται αυξημένος αριθμός δενδριτικών ακάνθων και συγκεκριμένα μανιταροειδών ακάνθων. Αυτό το αναπτυξιακό πρότυπο παρατηρήθηκε επίσης και στις ηλεκτροφυσιολογικές μας μελέτες, στις οποίες οι ηλικιακές ομάδες των «νεαρών» και «πρώιμων ενηλίκων» παρουσιάζουν αυξημένη μακρόχρονη ενδυνάμωση (long-term potentiation (LTP)) της συναπτικής διαβίβασης σε απόκριση τετανικού ερεθισμού, ενώ η ομάδα των «εφήβων» παρουσιάζει μειωμένη μακρόχρονη ενδυνάμωση. Τέλος, οι «έφηβοι» μύες έχουν μικρότερη απόδοση σε δοκιμές που εξαρτώνται από τον προμετωπιαίο φλοιό, όπως είναι η εναλλαγή βραχιόνων με καθυστέρηση στο λαβύρινθο τύπου Τ (T-maze) και στη συμπεριφορική δοκιμή αναγνώρισης αντικειμένων με χρονική σειρά, χωρίς να παρουσιάζουν αντίστοιχες διαφορές σε δοκιμές που δεν εξαρτώνται από τον προμετωπιαίο φλοιό, όπως είναι η δοκιμή αναγνώρισης νέου αντικειμένου (novel object recognition task) και νέας θέσης αντικειμένου (object-to-place recognition task). Στο κεφάλαιο ΙΙ, μελετήσαμε τον ρόλο της μειωμένης αναστολής στην φυσιολογία του προμετωπιαίου φλοιού και στην συμπεριφορά μυών, χρησιμοποιώντας τo διαγονιδιακό ποντίκι Rac1 conditional knockout (Rac1 cKO) που διαθέτει ~50% λιγότερους φλοιϊκούς διάμεσους νευρώνες εξαιτίας της απώλειας της πρωτεΐνης Rac1 από κύτταρα που εκφράζουν τον μεταγραφικό παράγονται Nkx2.1. Βρίσκουμε ότι τα ενήλικά Rac1 cKO παρουσιάζουν αυξημένη ευπάθεια σε φαρμακολογικά επαγόμενες επιληπτικές κρίσεις αλλά και αυξημένο άγχος. Σε κυτταρικό επίπεδο, τα Rac1 cKO παρουσιάζουν διαταραγμένη βραχύχρονη και μακρόχρονη πλαστικότητα (LTP) στον προμετωπιαίο φλοιό. Αλλαγές στην δενδριτική μορφολογία, όπως η μείωση των μανιταροειδών δενδριτικών ακάνθων και το μειωμένο μήκος των δενδριτών, θα μπορούσαν να υπόκεινται στη μείωση του LTP των Rac1 cKO. Σε τομές εγκεφάλου από Rac1 cKO, η ενίσχυση της GABAεργικής νευροδιαβίβασης με τη χρήση ήπιας δόσης διαζεπάμης ήταν επαρκής για την διάσωση του διαταραγμένου LTP. Τα παραπάνω ευρήματα μας οδήγησαν στην υπόθεση ότι το δίκτυο του προμετωπιαίου φλοιού των Rac1 cKO μυών παρουσιάζει μία ανισορροπία διέγερσης και αναστολής, που προκαλείται από την απορύθμιση του γλουταματεργικού συστήματος σε απόκριση της λειτουργικής μείωσης του GABAεργικού συστήματος, που τελικά έχουν ως αποτέλεσμα το αυξημένο άγχος και την ευαισθησία σε επιληπτικές κρίσεις. Μελετήσαμε επίσης και τους νεαρούς Rac1 cKO μύες που παρουσιάζουν μειωμένο άγχος και αυξημένη επαγωγή LTP μετά από τετανικό ερεθισμό, με μία υποκείμενη αύξηση του αριθμού των δενδριτικών ακάνθων σε σύγκριση με τα Rac1 Het (ετερόζυγα) ποντίκια, τα οποία χρησιμοποιούνται ως ομάδα ελέγχου. Τέλος, η οξεία ή χρόνια αναστολή του GABAεργικού συστήματος στα Rac1 Het ποντίκια με πικροτοξίνη επίσης διατάραξε το LTP στον προμετωπιαίο φλοιό. Τα αποτελέσματα μας προτείνουν ότι η κατάλληλη και επαρκής αναστολή κατά τη διάρκεια της παιδικής ηλικίας είναι κρίσιμη για την φυσιολογική ανάπτυξη των συναπτικών ιδιοτήτων αλλά και της πλαστικότητας κατά μήκος της στιβάδας ΙΙ του προμετωπιαίου φλοιού, όπως και την ανάπτυξη της φυσιολογικής συμπεριφοράς και των γνωσιακών λειτουργιών. Στο κεφάλαιο ΙΙΙ, προσεγγίσαμε υπολογιστικά, με τη χρήση ενός μοντέλου μικροκυκλώματος του προμετωπιαίου φλοιού, την επίδρασης της μειωμένης GABAεργικής αναστολής στις ιδιότητες της παραμένουσας δραστηριότητας, που θεωρείται το κυτταρικό υπόβαθρο της μνήμης εργασίας στον προμετωπιαίο φλοιό. Γι’ αυτό, κατασκευάσαμε ένα μικροκύκλωμα του προμετωπιαίου φλοιού, που αποτελείται από μοντέλα πυραμιδικών νευρώνων και τα τρία διαφορετικά είδη διάμεσων νευρώνων: γρήγορης πυροδότησης (fast-spiking (FS)), κανονικής πυροδότησης (regular-spiking (RS)), και ακανόνιστης πυροδότησης (irregular-spiking (IS)). Έγινε επαγωγή της παραμένουσας δραστηριότητας στο μοντέλο-μικροκύκλωμα και αναλύθηκαν οι ιδιότητές της. Αφαίρεση ή μείωση των εισόδων από το μοντέλο FS στους πυραμιδικούς νευρώνες-μοντέλα μείωσαν σημαντικά την βιοφυσική τροποποίηση της επαγωγής της παραμένουσας δραστηριότητας, μείωσαν τα χρονικά διαστήματα μεταξύ των δυναμικών ενεργείας (interspike intervals (ISIs)), τον νευρωνικό συγχρονισμό και τις ταλαντώσεις γάμμα ρυθμού κατά τη διάρκεια της παραμένουσας δραστηριότητας. Η επίδραση στον συγχρονισμό και στις ταλαντώσεις μπορούσε να αντιστραφεί με την προσθήκη άλλων ανασταλτικών εισόδων στο σώμα των πυραμιδικών κυττάρων, αλλά σε βαθμό πέραν των επιπέδων του κυκλώματος ελέγχου. Συνεπώς, γενικά η σωματική αναστολή δρα ως βηματοδότης της παραμένουσας δραστηριότητας και συγκεκριμένα η αναστολή από FS διάμεσους νευρώνες τροποποιεί το σήμα εξόδου αυτού του βηματοδότη. Συνολικά, τα αποτελέσματα μας συνεισέφεραν στην αναπτυσσόμενη γνώση στις λειτουργίες του προμετωπιαίου φλοιού κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης και στους υποκείμενους μηχανισμούς που καθιστούν τον προμετωπιαίο φλοιό «την περιοχή που οι άνθρωποι αξιώνουν για την ικανότητά της να ρυθμίζει τις σκέψεις μας και τις συμπεριφορές μας».