Συσχέτιση της ρετρομετάθεσης με την επιθηλιακή-μεσεγχυματική διαδικασία

Abstract

Retrotransposons are DNA sequences able to transpose and randomly integrate into newgenomic loci. Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT) occurs mainly in the normalembryogenesis but also participates in cancer progression through the processes of invasionand metastasis. An association between EMT and acquisition of cancer stem-cell propertieshas been proposed.Aim of the present dissertation was to investigate, whether: 1. retrotransposition eventsoccur in mammary epithelial cells, and 2. the outcome of retrotransposition is associated withEMT.In this study, the outcome of retrotransposition in mouse mammary cells was examinedby two approaches: a. the transfection of a non-autonomous Viral-Like 30 element (VL30) inprogenitor and differentiated mouse mammary cells, and b. the transfection of retrotransposonVL30 or a non-LTR human active L1 retrotransposon or retrovirus MoMLV (as LTRretrotransposon) in progenitor mouse mammary cells.The major findings of this work are:1. FACS analysis showed that the transfection of non-autonomous VL30retrotransposon in progenitor HC11 mouse mammary cells produced a higherretrotransposition frequency, in comparison to that of differentiated C127 and EPH4 cells.Also, the transfection of retrotransposon L1 or retrovirus MoMLV in HC11 cells producedhigh retrotransposition frequencies.2. In contrast to the retrotransposition-positive C127 and EPH4 cells, whichretained their epithelial phenotype, HC11-VL30 clone cells acquired a mesenchymalphenotype. Similarly, HC11-L1 clones showed a mesenchymal phenotype but no particularphenotypic changes were observed in HC11-DO.MT clones.3. Immunofluorescence and western blot analysis in HC11-VL30 cells showed acomplete loss of E-cadherin expression, a diffuse localization pattern for β-catenin, induction of N-cadherin and fibronectin expression, while Real-time RCR revealed RNA induction ofthe transcriptional factors Snail, Twist, Slug, and TGF-β1. In parallel, HC11-L1 cells exhibited a similar expression profile for these EMT-markers, with the exception that of TGF-β whereno significant changes were observed in its RNA expression.4. The retrotransposition- and EMT-positive HC11-VL30 and HC11-L1 cellswere characterized by an increased metastatic potential, compared to HC11-control cells,invasion ability in matrigel and colony formation in soft agar.5. The EMT-positive HC11-VL30 and HC11-L1 cells could grow in low serumand form mammospheres under ancorage-independent cell culture conditions.6. Cells deriving either from HC11-VL30 or HC11-L1 mammospheres exhibited:a. a CD44+/CD24-/low antigenic CSCs-phenotype, b. induction of Oct4 RNA expression, and c.self-renewal and differentiation properties. In addition, two distinct differences were observedbetween HC11-VL30 and HC11-L1 mammosphere cells: d. only the HC11-L1 mammospherecells were characterized by induced Nanog RNA expression, and e. whereas the HC11-VL30mammosphere cells were differentiated to mammary acini-like structures, the respectiveHC11-L1 mammospheres gave rise mainly to mesenchymal cell structures and to a lesserpercentage of epithelial cells.7. Injection of retrotransposition-positive HC11-VL30 and HC11-L1 cells intosyngeneic Balb/c mice produced tumours. In HC11-VL30 tumour sections, cohesive clustersof tumour cells were positive for pancytoceratin expression.8. Isolated tumour cells from HC11-L1 neoplasms exhibited a mesenchymalmorphology, were able to form mammospheres under low-binding growth conditions and wereretrotransposition-positive, as was shown by PCR analysis

Τα ρετροτρανσποζόνια είναι αλληλουχίες DNA, ικανές να μετατίθενται σε νέες θέσεις στο γένωμα. Η επιθηλιακή προς μεσεγχυματική μετάπτωση (ΕΜΤ) εμφανίζεται κυρίως κατά την εμβρυογένεση, ενώ η επαγωγή της στην ενήλικη ζωή συμβάλλει στην καρκινογένεση.Έχει προταθεί η συσχέτιση μεταξύ επαγωγής ΕΜΤ και καρκινικών βλαστικών κυττάρων.Σκοπός της διατριβής αυτής αποτέλεσε η διερεύνηση εάν: 1. γεγονότα ρετρομετάθεσης συμβαίνουν σε επιθηλιακά κύτταρα μαστού και κυρίως, 2. οι επιπτώσεις της ρετρομετάθεσης συσχετίζονται με ΕΜΤ. Τα κύρια ευρήματα της παρούσας διατριβής είναι τα ακόλουθα:1. Κυτταρομετρία ροής, έδειξε ότι η διαμόλυνση του μη-αυτόνομου ρετροτρανσποζονίου VL30 σε προγονικά κύτταρα μαστού ποντικού HC11 οδήγησε στην παραγωγή υψηλότερης συχνότητας ρετρομετάθεσης, συγκριτικά με τα διαφοροποιημένα κύτταρα μαστού C127 και EPH4. Επίσης, η διαμόλυνση του ρετροτρανσποζονίου L1 και του ρετροϊού MoMLV ως ρετροτρανσποζόνιο σε κύτταρα HC11 παρήγαγε γεγονότα ρετρομετάθεσης υψηλής συχνότητας. 2. Σε αντίθεση με τα θετικά ρετρομετάθεσης κύτταρα C127 και EPH4, τα οποία διατήρησαν τον επιθηλιακό τους φαινότυπο, κυτταρικοί κλώνοι HC11-VL30 απόκτησαν ένα μεσεγχυματικό φαινότυπο. Παρομοίως, μεσεγχυματική μορφολογία παρουσίασαν και οι θετικοί ρετρομετάθεσης κλώνοι HC11-L1, σε αντίθεση με τους κλώνους HC11-DO.MT στους οποίους δεν παρατηρήθηκαν ιδιαίτερες μορφολογικές διαφορές.3. Επίσης σε κλώνους HC11-VL30, ανοσοαποτύπωση κατά western και ανοσοφθορισμός έδειξε πλήρη απώλεια έκφρασης της Ε-καντερίνης, ενός διάχυτου πρότυπου εντοπισμού της β-κατενίνης και επαγωγή της έκφρασης Ν-καντερίνης και φιμπρονεκτίνης καθώς ανάλυση Real Time PCR απεκάλυψε επαγωγή RNA έκφρασης των παραγόντων Snail,Twist, Slug και της κυτοκίνης TGF-β1. Παράλληλα, κύτταρα HC11-L1 παρουσίασαν παρόμοιο προφίλ έκφρασης των παραπάνω δεικτών EMT, με εξαίρεση τη TGF-β1 όπου δεν παρατηρήθηκε ιδιαίτερη μεταβολή RNA έκφρασή της.4. Τα θετικά ρετρομετάθεσης κύτταρα HC11-VL30 και HC11-L1 χαρακτηρίστηκαν από αυξημένο μεταστατικό δυναμικό συγκριτικά με τα κύτταρα HC11,ικανότητα διήθησης σε γέλη matrigel και σχηματισμό αποικιών σε μαλακό άγαρ. 5. Κύτταρα κλώνων HC11-VL30 και HC11-L1 με επαγμένη ΕΜΤ ήταν ικανά ανάπτυξης υπό συνθήκες χαμηλής συγκέντρωσης ορού και σχημάτιζαν μαμμόσφαιρες σε μέσα μειωμένης προσκόλλησης.6. Κύτταρα προερχόμενα από μαμμόσφαιρες κλώνων HC11-VL30 και HC11-L1 χαρακτηρίστηκαν θετικά ως προς: α. τον αντιγονικό φαινότυπο των καρκινικών βλαστικών κυττάρων CD44+/CD24-/low, β. επαγωγή έκφρασης RNA του γονιδίου Oct4 και γ. ικανότητες αυτοανανέωσης και διαφοροποίησης. Επιπλέον, παρουσιάστηκαν δύο χαρακτηριστικές διαφορές μεταξύ των κυττάρων μαμμοσφαιρών HC11-L1 και HC11-VL30: δ. μόνο οι μαμμόσφαιρες HC11-L1 χαρακτηρίστηκαν από αυξημένη έκφραση RNA του γονιδίου Nanogκαι ε. ενώ τα κύτταρα μαμμοσφαιρών HC11-VL30 διαφοροποιήθηκαν σε δομές που ομοιάζαν με αυτές του γαλακτοφόρου αδένα, τα κύτταρα μαμμοσφαιρών HC11-L1 διαφοροποιήθηκαν σε κυτταρικές δομές αποτελούμενες κυρίως από μεσεγχυματικά κύτταρα και σε μικρότερο ποσοστό από επιθηλιακά.7. Ένεση κυττάρων HC11-VL30 και HC11-L1 στα συγγενικά ποντίκια Balb/cοδήγησε στη παραγωγή όγκων. Στην περίπτωση νεοπλάσματος από κύτταρα HC11-VL30,αθροίσεις νεοπλασματικών κυττάρων χαρακτηρίσθηκαν, κατά θέσεις, από θετικότητα ως προς την πανκερατίνη υποδηλώνοντας εστιακή επιθηλιακή διαφοροποίηση. 8. Απομονωμένα καρκινικά κύτταρα από νεοπλάσματα HC11-L1 παρουσίασαν μεσεγχυματική μορφολογία, ικανότητα σχηματισμού μαμμοσφαιρών, υπό συνθήκες μειωμένης προσκόλλησης και θετικότητα ως προς τα γεγονότα ρετρομετάθεσης έπειτα από ανάλυση PCR.