Μηχανισμοί διεύρυνσης του φάσματος υποστρωμάτων των β- λακταμασών μοριακών τάξεων Α και C

Abstract

The effects of mutations in positions 104 and 170 of naturally occurring class A enzymes of GES type (i.e. Glu104Lys, Gly170Asn and Gly170Ser) as well as in position 211 of CMY-2 type class C beta-lactamases (Val211Gly – CMY-30; Val211Ser – CMY-42) were studied. The effects of each mutation on enzyme function was assessed through steady state enzyme kinetics while their role during their interactions with β-lactams was analyzed through inhibition studies using boronic acids substituted with the oxyimino side chains of 3rd generation cephalosporins. The role of each mutation on enzyme thermal stability was estimated by denaturation experiments. Structural changes induced by each mutation were examined by molecular dynamics simulations of free enzymes, ceftazidime and cefoxitin acyl-enzymes as well as of complexes with the boronoc acid analogue of ceftazidime. In GES enzymes Gly170Asn and Gly170Ser increased the hydrolytic efficiency towards carbapenems while enzymes with serine were also active against cefoxitin. Glu104Lys caused substrate expansion towards oxyimino cephalosporins. Structural analysis showed that Gly170Asn and Gly170Ser stabilized and strengthened the interactions between aminoacids of the catalytic apparatus. It was suggested that carbapenem hydrolysis by GES type enzymes is analogues to the strength of interactions between the catalytic residues Glu166. Lys73 and Ser70. Enzymes with Lys in position 104 exhibited higher affinity for negatively charged oxyimino side chains. However, the increased hydrolysis is likely to be due to additional phenomena as laboratory mutants of position 104 with non-polar side chains exhibited also extended spectrum character. Val211Gly and Val211Ser in CMY-2 caused increased hydrolysis of oxyimino β-lactams. The above was accompanied by lower affinity for oxyimino side chains and lower thermal stability in the presence and absence of the above ligands. Molecular dynamics simualtions showed that the extended spectrum enzymes was more flexible permitting the adaptation of conformations of ceftazidime acyl-enzyme that were nearer to the deacylation transition state with higher frequency compared to CMY-2. Moreover the attack of the hydrolytic water into the β-face of the esteric bond proceeded less obstructed.

Μελετήθηκαν οι επιδράσεις μεταλλάξεων στις θέσεις 104 και 170 που απαντούν στις φυσικές β-λακταμάσες τάξης Α τύπου GES (ήτοι Glu104Lys, Gly170Asn και Gly170Ser) καθώς και στη θέση 211 ενζύμων τάξης C τύπου CMY-2 (Val211Gly – CMY-30; Val211Ser – CMY-42). Η επίδραση της κάθε μετάλλαξης στην λειτουργία των ενζύμων προσδιορίστηκε με πειράματα ενζυμικής κινητικής στην κατάσταση ισορροπίας ενώ ο ρόλος αυτών κατά την αλληλεπίδραση με β-λακταμικά μόρια εξετάσθηκε με πειράματα αναστολής χρησιμοποιώντας βορονικά οξέα που έφεραν τις οξυίμινο πλευρικές αλυσίδες των κεφαλοσπορινών 3ης γενεάς. Επιπλέον προσδιορίστηκε ο ρόλος των μεταλλάξεων στη θερμική σταθερότητα των ενζύμων μέσω πειραμάτων αποδιάταξης. Οι δομικές αλλαγές που προκαλούνταν από την κάθε μετάλλαξη εκτιμήθηκαν με προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής ελεύθερων ενζύμων, ακύλ-ενζύμων κεφταζιδίμης και κεφοξιτίνης καθώς και συμπλόκων με το βορονικό ανάλογο της κεφταζιδίμης. Στα ένζυμα τύπου GES βρέθηκε ότι οι Gly170Asn και Gly170Ser αυξάνουν την υδρολυτική ικανότητα έναντι καρβαπενεμών, ενώ ένζυμα με σερίνη στην συγκεκριμένη θέση υδρέλυαν και την κεφοξιτίνη. Η Glu104Lys διεύρυνε το φάσμα υποστρωμάτων προς τις οξυίμινο κεφαλοσπορίνες. Η δομική ανάλυση έδειξε ότι οι Gly170Asn και Gly170Ser προκαλούσαν ισχυροποίηση του δικτύου αλληλεπιδράσεων των αμινοξέων της καταλυτικής μηχανής. Προτάθηκε ότι η υδρόλυση καρβαπενεμών από τα ένζυμα τύπου GES είναι ανάλογη της ισχύος των αλληλεπιδράσεων των καταλυτικών αμινοξέων Glu166, Lys73 και Ser70. Τα ένζυμα με Lys στη θέση 104 είχαν υψηλότερη συγγένεια για τις αρνητικά φορτισμένες οξυίμινο πλευρικές αλυσίδες. Η αυξημένη υδρόλυση οξυίμινο κεφαλοσπορινών πιθανότατα οφείλεται σε επιπλέον φαινόμενα καθώς εργαστηριακοί μεταλλάκτες της θέσης 104 που έφεραν μη πολικά αμινοξέα παρουσίαζαν επίσης έντονο χαρακτήρα εκτεταμένου φάσματος. Οι Val211Gly και Val211Ser στη CMY-2 οδηγούσαν σε αυξημένη υδρόλυση οξυίμινο β-λακταμικών. Το παραπάνω συνδυάζονταν με μειωμένη συγγένεια έναντι των οξυίμινο πλευρικών αλυσιδών και με μειωμένη θερμική σταθερότητα απουσία και παρουσία των παραπάνω προσδετών. Οι προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής έδειξαν ότι τα ένζυμα εκτεταμένου φάσματος ήταν περισσότερο ευέλικτα επιτρέποντας την εμφάνιση διαμορφώσεων των ριζών ακυλ-ενζύμου της κεφταζιδίμης που ομοίαζαν δομικά με την κατάσταση μετάπτωσης της απακυλίωσης με υψηλότερη συχνότητα σε σύγκριση με τη CMY-2. Επίσης η επίθεση του υδρολυτικού νερού στη β-επιφάνεια του εστερικού δεσμού ήταν λιγότερο παρεμποδισμένη.