Μελέτη των πρωτεολυτικών μηχανισμών και των ρυθμιστών τους στις νεοπλασίες των όρχεων

Abstract

Testicular tumors are the most frequent solid tumors in young men (20-40 years old) and they are mainly arising from the germ cells (90%). The germ cell tumors can be divided into two main sub-categories, the seminomatous tumors and the non-seminomatous tumors. The non-seminomatous tumors can be further classified into different sub-categories and they are more aggressive with unfavorable prognosis compared to the seminomatous tumors. Although numerous studies have been performed concerning the epidemiology, the etiology and the pathogenetic mechanisms involved in the progression of testicular tumors, little is known about the mechanisms and the possible factors which involved in the ability of those cells to migrate and to invade. The proteases of extracellular matrix, like the metalloproteinases (MMPs) and the plasmin activators (PAs), have the ability to degrade the matrix and as consequence they contribute to the migration and the invasion of the tumor cells. EMMPRIN, as an inducer of MMPs, is playing a crucial role in the ability of tumor cells to migrate and invade. The aim of this study was to identify new prognostic factors in the testicular tumors. For this purpose, the expression of MMPs, uPA, tPA, EMMPRIN but also of TIMPs has been examined in testicular tumors and in seminoma and non-seminoma germ cell lines, as their biological role has never been determined previously in this malignancy. The expression of MMPs and TIMPs but also of PAs has been examined, in primary tumors obtained from biopsy and it has been compared with their expression in healthy testicular tissues taken from autopsies. Furthermore, the expression of those molecules has been studied in cell lines of testicular tumors (JKT-1, seminoma, NTERA2/D1, embryonal carcinoma, NCCIT, teratocarcinoma). The results from both studies were in complete agreement and they have shown increased levels of proMMP-2/-9 but also of their active forms, as well as elevated levels of uPA in the tumor tissues and in the most aggressive cell lines (embryonal carcinoma, teratocarcinoma). As far as the TIMPs’ levels are concerned, a significant reduction has been noticed in the more aggressive non-seminomatous cell lines compared with the seminoma one. The results revealed more elevated levels of proMMP-2 and proMMP-9 and lower levels of TIMP-1 and TIMP-2 in the more aggressive cell lines, which have also presented higher invading ability. The participation of MMPs in the increased invassiveness of the teratocarcinoma cell line (NCCIT) and of embryonal carcinoma cell line (NTERA2/D1) has been proved in vitro, as in the presence of the specific inhibitor of MMPs (Marimastat) but also of TIMPs, the invading ability of the cells has been reduced. The evaluation of the expression of MMP-2 and MMP-9 in samples from patients with testicular tumors and their correlation with their clinicopathological characteristics has shown that only the increased levels of MMP-9 are associated with the metastatic potential of testicular tumors and angiogenesis in vivo. Additionally, the expression and the role of EMMPRIN have been studied in testicular tumor cell lines. It has been shown that in these cell lines, EMMPRIN doesn’t maintain a specific expression pattern and it shows a high heterogeneity in its glycosylation. It has been shown that EMMPRIN expressed from the more aggressive cells of embryonal carcinoma (NTERA2/D1), abandons the cells in a high rate through microvesicels and it is active as it causes the induction of MMPs (MMP-2 and MMP-1) in the adjacent fibroblasts. In contrast, EMMPRIN expressed by the seminoma cell line was found to be directly related to the Caveolin-1, probably to obstruct its maturation and consequently its activation. Taken together, the results of this study demonstrate, for first time, the role of MMP-2/MMP-9, of TIMPs but also of PAs, in testicular tumors, where the elevated expression of the proteolytic enzymes has been shown and in the same time it has been shown the reduced expression of TIMPs in the more metastatic non-seminomatous cell lines. Additionally, the role of EMMPRIN was shown to be complex in the testicular tumors and has not been shown to be correlated exclusively with its expression levels and the presence in the neoplasmatic cells. The present study suggests that MMPs, PAs and EMMPRIN are molecules which regulate the proteolytic potential of testicular tumors and they may represent biological markers of prognostic significance.

Οι όγκοι των όρχεων είναι οι πιο συνήθεις συμπαγείς όγκοι στους νέους άνδρες ηλικίας 20 με 40 ετών και προέρχονται κυρίως (90%) από τα βλαστικά κύτταρα. Οι όγκοι των όρχεων εκ βλαστικών κυττάρων κατηγοριοποιούνται σε δύο κύριες υποκατηγορίες, τους σεμινωματώδεις όγκους και τους μη-σεμινωματώδεις όγκους. Οι μη-σεμινωματώδεις όγκοι κατηγοριοποιούνται περαιτέρω σε υποκατηγορίες και εμφανίζουν μεγαλύτερη επιθετικότητα και δυσμενέστερη πρόγνωση σε σχέση με τους σεμινωματώδεις όγκους. Παρόλο που πολυάριθμες μελέτες έχουν γίνει σχετικά με την επιδημιολογία, την αιτιολογία και τους παθογενετικούς μηχανισμούς που εμπλέκονται στην ανάπτυξη των όγκων των όρχεων, λίγα πράγματα είναι γνωστά σχετικά με τους μηχανισμούς και τους πιθανούς παράγοντες που εμπλέκονται στην ικανότητα αυτών των κυττάρων να διηθούν και να μεθίστανται. Οι πρωτεϊνάσες του εξωκυττάριου χώρου, όπως είναι οι MMPs και οι ενεργοποιητές του πλασμινογόνου (uPA και tPA), έχουν την ικανότητα να αποικοδομούν την εξωκυττάρια ουσία, με αποτέλεσμα να συμβάλλουν στην διήθηση και την μετάσταση των νεοπλασματικών κυττάρων. Ο EMMPRIN, ως επαγωγέας των MMPs, παίζει σημαντικό ρόλο στην αύξηση της ικανότητας των νεοπλασματικών κυττάρων να μεθίστανται. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν να αναγνωριστούν νέοι πιθανοί προγνωστικοί δείκτες στους όγκους των όρχεων. Για αυτό το λόγο μελετήθηκε η έκφραση των MMPs, uPA, tPA, EMMPRIN αλλά και των TIMPs, σε ιστούς όγκων όρχεων και σε κυτταρικές σειρές σεμινώματος και μη-σεμινώματώδεις, αφού ο βιολογικός ρόλος τους δεν έχει ποτέ προσδιοριστεί σε αυτή την κακοήθεια. Αρχικά μελετήθηκε η έκφραση των MMPs, των TIMPs αλλά και των PAs σε βιοψίες ασθενών και συγκρίθηκε με την έκφρασή τους σε φυσιολογικούς ορχικούς ιστούς που ελήφθησαν από νεκροψίες. Ενώ σε δεύτερη φάση μελετήθηκε η έκφραση των ίδιων μορίων σε κυτταρικές σειρές όγκων των όρχεων (JKT-1, σεμίνωμα, NTERA2/D1, εμβρυϊκό καρκίνωμα, NCCIT, τερατοκαρκίνωμα). Τα αποτελέσματα και από τις δυο μελέτες, ήρθαν σε απόλυτη συμφωνία και έδειξαν αυξημένα επίπεδα των proMMP-2/-9 αλλά και των ενεργών μορφών τους καθώς και αυξημένα επίπεδα του uPA στους νεοπλασματικούς ιστούς και στις πιο επιθετικές κυτταρικές σειρές (εμβρυϊκό καρκίνωμα και τερατοκαρίνωμα). Όσον αφορά στα επίπεδα των TIMPs παρατηρήθηκε σημαντικά ελαττωμένη έκφρασή τους στις πιο επιθετικές μη-σεμινωματώδεις κυτταρικές σειρές σε σχέση με το σεμίνωμα. Τα αποτελέσματα έδειξαν υψηλότερα επίπεδα proMMP-2 και proMMP-9 και χαμηλότερα επίπεδα TIMP-1 και ΤΙΜΡ-2 στις επιθετικές κυτταρικές σειρές, οι οποίες παρουσίασαν και υψηλότερη διηθητική ικανότητα. Η εμπλοκή των MMPs στην αυξημένη διηθητική ικανότητα των κυτταρικών σειρών του τερατοκαρκινώματος (NCCIT) και του εμβρυϊκού καρκινώματος (NTERA2/D1) αποδείχθηκε in vitro, αφού παρουσία ειδικού αναστολέα των MMPs (Marimastat) καθώς και TIMPs ελαττώθηκε η διηθητική τους ικανότητα. Η αξιολόγηση της έκφρασης των MMP-2 και MMP-9 σε δείγματα από ασθενείς με όγκους όρχεων και η συσχέτισή τους με τα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά τους έδειξε ότι μόνο η αυξημένη παρουσία της MMP-9 συνδέεται με την επιθετικότητα των όγκων των όρχεων και την αγγειογένεση in vivo. Τέλος μελετήθηκε η έκφραση αλλά και ο ρόλος του EMMPRIN στις κυτταρικές σειρές όγκων όρχεων. Φάνηκε ότι στις σειρές αυτές, ο EMMPRIN δεν διατηρεί ένα συγκεκριμένο πρότυπο έκφρασης και εμφανίζει υψηλή ετερογένεια στα επίπεδα γλυκοζυλίωσης. Δείχθηκε ότι ο EMMPRIN που εκφράζεται από τα επιθετικά κύτταρα του εμβρυϊκού καρκινώματος (NTERA2/D1) εγκαταλείπει τα κύτταρα σε πολύ μεγάλο βαθμό μέσω των μικροκυστιδίων και είναι ενεργός αφού προκαλεί την επαγωγή των MMPs (MMP-2 και MMP-1) στους παρακείμενους ινοβλάστες του μικρο-περιβάλλοντος του. Αντίθετα, ο EMMPRIN στη κυτταρική σειρά του σεμινώματος βρέθηκε να συνεντοπίζεται με την Cav-1, γεγονός που είναι πιθανόν να εμποδίζει την ωρίμανσή του και συνεπώς να παραμένει ανενεργός. Συμπερασματικά, στην παρούσα διατριβή, καταδεικνύεται για πρώτη φορά, ο ρόλος των MMP-2/ΜΜΡ-9, των TIMPs αλλά και των PAs, στους όγκους των όρχεων όπου φαίνεται η αυξημένη έκφραση των πρωτεολυτικών ενζύμων και η ταυτόχρονη ελαττωμένη έκφραση των TIMPs στις πιο μεταστατικές μη-σεμινωματώδεις κυτταρικές σειρές. Επιπλέον, ο ρόλος του EMMPRIN στους όγκους των όρχεων δεν φαίνεται να σχετίζεται αποκλειστικά με τα επίπεδα έκφρασής του και την παρουσία του στα νεοπλασματικά κύτταρα αλλά είναι σύνθετος. Η παρούσα μελέτη προτείνει ότι οι MMPs, PΑs και ο EMMPRIN αποτελούν μόρια που ρυθμίζουν άμεσα το πρωτεολυτικό δυναμικό των όγκων των όρχεων και μπορούν να αποτελέσουν επιπρόσθετους βιολογικούς δείκτες με προγνωστική σημασία.