Μελέτη αναδιατάξεων των γονιδίων της κ-ελαφριάς αλυσίδας των ανοσοσφαιρινών σε ασθενείς με χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία και πολλαπλούν μυέλωμα

Abstract

1. CHRONIC LYMPHOCYTIC LEUKEMIA: Immunoglobulin kappa (IGK) locus rearrangements were analyzed in parallel on cDNA/genomic DNA in 188 kappa- and 103-lambda chronic lymphocytic leukemia (CLL) cases. In kappa-CLL, 219IGKV-J clonal rearrangements were amplified in 188cases. Thirty-one cases (16.5%) carried double rearrangements; both rearrangements were in-frame in 14/188 cases (7.44%). Double in-frame IGKV-J transcripts were detected in only 3/188 cases (1.6%). In such cases, the possibility that leukemic cells expressed more than one kappa chain cannot be excluded. Twenty-one functional IGKV genes belonging to the IGKV1-4 subgroups were identified in 191 transcribed, in-frame IGKV-J rearrangements. IGKV3-20 was the most frequent IGKV gene, followed by IGKV1-39/1D-39, IGKV1-5, IGKV4-1, IGKV2- 30 and IGKV3-11. IGKV-KDE and IGKJ-C-INTRON-KDE rearrangements were also analyzed on genomic DNA. Taking IGKV-J, IGKV-KDE and IGKJ-C-INTRON-KDE rearrangements together, 38% of kappa-CLL cases carried biallelic IGK locus rearrangements. In lambda-CLL, 69 IGKV-J rearrangements were detected in 64/103 cases (62%); 24 rearrangements (38.2%) were in-frame. Four cases carried in-frameIGKV-J transcripts but retained monotypic light chain expression, suggesting posttranscriptional regulation of allelic exclusion. Nineteen different genes of the IGKV1-5 subgroups were used; IGVK4-1 was the most frequent IGKV gene, followed by IGKV1-33/1D-33, IGKV1-39/1D-39, IGKV2-30 and IGKV1-16. In all, taking IGKV-J, IGKV-KDE and IGKJ-C-INTRON-KDE rearrangements together, 97% of lambda-CLL cases had at least one rearranged IGK allele, in keeping with normal cells. IG repertoire comparisons in kappa vs. lambda CLL revealed that CLL precursor cells tried many rearrangements on the same IGK allele before they became lambda producers. Thirteen out of 28 and 26/69 non-expressed sequences in, respectively, kappa- or lambda-CLL had <100% homology to germline. This finding might be considered as evidence for secondary rearrangements occurring after the onset of somatic hypermutation, at least in some cases. The inactivation of potentially functional IGKV-J joints by secondary rearrangements indicates active receptorediting in CLL and provides further evidence for the role of antigen in CLL immunopathogenesis.2. MULTIPLE MYELOMA: Fifty-two IGKV-J clonal rearrangements were amplified in 43 k-MM cases. Nine cases carried double rearrangements; double in-frame IGKV-J transcripts were detected in one case. Sixteen functional IGKV genes of the IGKV1-4 subgroups were identified in the transcribed, in-frame IGKV-J rearrangements. Six different IGKV genes were identified in ten out-of-frame and/or non-transcribed IGKV-J rearrangements; the IGKV4-1 gene was used in 4/10 cases. Nineteen clonal IGKV-J rearrangements were amplified in 17 lamda-MM cases; two cases carried 2 differentrearrangements. Ten different germline genes of the IGKV1/2/3/4/7 subgroups were identified. IGVK4-1 was the most frequent IGKV gene, followed by IGKV1-33/1D-33 and IGKV1-39/1D-39. Eight out of 19 rearrangements (42%) were in-frame, while 11/19 rearrangements (58%) were out-of-frame. Nine out of 43 kappa-MM cases (20.9%) carried IGKV-KDE rearrangements; IGKJ-C-INTRON-KDE rearrangements were amplified in 8/43 cases (18.6%). Overall, 17/43 kappa-MM cases (39.5%) carried monoallelic KDE rearrangements leading to IGK locus inactivation on thatparticular allele. In lambda-MM, IGKV-KDE and IGKJ-C-INTRON-KDE rearrangements were amplified in 15/42 cases (35.7%) and 26/42 cases (61.9%), respectively. In both kappa- and lambda-MM, the IGKV gene repertoire in IGKV-KDE rearrangements was diverse; IGKV2-30 was the most frequent gene. Nineteen out of 43 kappa-MM cases (44.2%) analyzed for IGKV-J, IGKV-KDE and IGKJ-C-INTRONKDE rearrangements carried only one IGK locus rearrangement in the form of a single IGKV-J joint. PCR evidence for biallelic IGK locus rearrangements was obtained in: (i) 17/43 cases (39.5%) carrying a rearrangement to the KDE along with an expressed IGKV-J rearrangement, and (ii) 5/43 cases (11.6%) with double IGKVJ rearrangements. In such cases, biallelic IGK rearrangements were suggested by IGKJ gene repertoire analysis as well as location and mode of recombination of the IGKV genes identified in both rearrangements. In four kappa-MM cases, both IGKV-J rearrangements could have occurred sequentially on either one or both IGK alleles. Only six out of 42 (14.3%) lambda-MM cases had no PCR evidence for IGK locus rearrangements. Eighteen cases carried one rearrangement on the IGK locus, while 12 and 6 cases, respectively; bore two or three IGK locus rearrangements. All transcribed, in-frame IGKV-J rearrangements in kappa-MM were mutated. Seven out of ten non-transcribed and/or out-of-frame IGKV-J rearrangements in kappa-MM had 100% homology to germline. Two out of the remaining three rearrangements wereheavily mutated and also carried crippling mutations. In lambda-MM, six out of 19 IGKV-J rearrangements had less than 100% homology to germline, of which five were in-frame; 3/6 mutated cases had less than 98% homology. In conclusion, the MM clonogenic cell has been positively selected during the development and reaction of the germinal center. Biases in IG repertoire do not seem to be diseaserelated but generally follow a similar pattern to the normal repertoire.

1. ΧΡΟΝΙΑ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑ: Αναλύθηκαν αναδιατάξεις του γενετικού τόπου IGK με DNA-PCR και RT-PCR σε 188 περιπτώσεις κ- και 103 περιπτώσεις λ-ΧΛΛ. Σε 188 περιπτώσεις κ-ΧΛΛ ενισχύθηκαν 219 κλωνικές αναδιατάξεις IGKV-J. Τριάντα μία περιπτώσεις (16.5%) έφεραν διπλές αναδιατάξεις. Διπλές εντός πλαισίου αναδιατάξεις ενισχύθηκαν σε 14/188 περιπτώσεις (7.44%). Μόνο σε 3/188 (1.6%) περιπτώσεις ανιχνεύθηκαν διπλά εντός πλαισίου μετάγραφα IGKV-J. Σε αυτές τις περιπτώσεις δεν μπορεί να αποκλειστεί το ενδεχόμενο να εκφράσθηκαν περισσότερες από μια κ ελαφριά αλυσίδα. Εικοσι-ένα λειτουργικά γονίδια IGKV που ανήκουν στις υποομάδες IGKV1-4 ανιχνεύθηκαν στις 191 μεταγραφόμενες, εντός πλαισίου αναδιατάξεις IGKV-J. Το γονίδιο IGKV3-20 ήταν το πιο συχνό γονίδιο IGKV, ακολουθούσαν τα IGKV1-39/1D- 39, IGKV1-5, IGKV4-1, IGKV2-30 και IGKV3-11. Επίσης, αναλύθηκαν αναδιατάξεις IGKV-KDE και IGKJ-C-INTRON-KDE με DNA-PCR. Συνυπολογίζοντας τις αναδιατάξεις IGKV-J, IGKV-KDE και IGKJ-C-INTRON-KDE, 38% των περιπτώσεων κ- ΧΛΛ έφεραν διαλληλικές αναδιατάξεις στο γενετικό τόπο IGK. Στην λ-ΧΛΛ, 69 αναδιατάξεις IGKV-J ανιχνεύθηκαν σε 64/103 περιπτώσεις (62%): 24 αναδιατάξεις (38.2%) ήταν εντός πλαισίου. Τέσσερις περιπτώσεις έφεραν εντός πλαισίου μετάγραφα IGKV-J όμως διατηρούσαν μονοτυπική έκφραση ελαφριάς αλυσίδας, εύρημα που υποδηλώνει μετα-μεταγραφική ρύθμιση του αποκλεισμού αλληλομόρφου. Χρησιμοποιήθηκαν 19 διαφορετικά γονίδια των υποομάδων IGKV1-5. Το γονίδιο IGKV4-1 ήταν το πιο συχνό γονίδιο IGKV. Συνυπολογίζοντας τις αναδιατάξεις IGKV-J, IGKV-KDE και IGKJ-C-INTRON-KDE, το 97% των περιπτώσεων λ-ΧΛΛ είχαν τουλάχιστον ένα αναδιαταγμένο αλληλόμορφο IGK, σε αντιστοιχία με τα φυσιολογικά κύτταρα. Δεκατρείς από τις 28 και 26/69 μη εκφραζόμενες αλληλουχίες στην κ- ή λ- ΧΛΛ, αντίστοιχα, είχαν <100% ομολογία με τα γονίδια της γαμετικής σειράς. Το εύρημα αυτό μπορεί να θεωρηθεί ως ένδειξη για δευτερογενείς αναδιατάξεις πριν την έναρξη της σωματικής υπερμεταλλαξιγένεσης. Η αδρανοποίηση δυνητικά λειτουργικών συμβολών IGKV-J υποδηλώνει την ύπαρξη ενεργού μηχανισμού αναθεώρησης του υποδοχέα στην ΧΛΛ και παρέχει περαιτέρω ενδείξεις για το ρόλο του αντιγόνου στην παθογένεση της ΧΛΛ. 2. ΠΟΛΛΑΠΛΟΥΝ ΜΥΕΛΩΜΑ: Σε 43 περιπτώσεις κ-ΠΜ ενισχύθηκαν 52 κλωνικές αναδιατάξεις IGKV-J. Εννέα περιπτώσεις έφεραν διπλές αναδιατάξεις, ενώ διπλά εντός πλασίου (IF) μετάγραφα ανιχνεύθηκαν σε μια περίπτωση. Στα 42 IF μετάγραφα IGKV-J αναγνωρίσθηκαν 16 λειτουργικά γονίδια IGKV των υποομάδων IGKV1-4. Το γονίδιο IGKV4-1 επικρατούσε στα IF μετάγραφα, ενώ ακολουθούσαν τα IGKV1-39/1D-39, IGKV1-33/1D-33 και IGKV3-20. Έξι διαφορετικά γονίδια IGKV αναγνωρίσθηκαν σε δέκα εκτός πλαισίου (OF) και/ή μη μεταγραφόμενες αναδιατάξεις IGKV-J: το γονίδιο IGKV4-1 χρησιμοποιήθηκε σε 4/10 περιπτώσεις. Σε 17 περιπτώσεις λ-ΠΜ ενισχύθηκαν 19 κλωνικές αναδιατάξεις IGKV-J: δύο περιπτώσεις έφεραν δυο διαφορετικές αναδιατάξεις. Αναγνωρίσθηκαν 10 διαφορετικά γονίδια των υποομάδων IGKV1/2/3/4/7. Το γονίδιο IGKV4-1 επικρατούσε, ενώ ακολουθούσαν τα IGKV1-33/1D- 33 και IGKV1-39/1D-39. Οκτώ από τις 19 αναδιατάξεις (42%) ήταν IF, ενώ 11/19 αναδιατάξεις (58%) ήταν OF. Σε 17/43 περιπτώσεις κ-ΠΜ (39.5%) βρέθηκαν ενδείξεις για μονοαλληλικές αναδιατάξεις της αλληλουχίας KDE που οδήγησαν σε λεπουργκή αδρανοποίηση του συγκεκριμένου αλληλομόρφου. Το γονίδιο IGKV4-1 επικρατούσε στις αναδιατάξεις IGKV-KDE (3/10 περιπτώσεις). Στο λ-ΠΜ, 42 περιπτώσεις αναλύθηκαν για μη παραγωγικές αναδιατάξεις IGKV-KDE και IGKJ-C-INTRON-KDE. Αναδιατάξεις IGKV-KDE ενισχύθηκαν σε 15/42 (35.7%) περιπτώσεις, ενώ αναδιατάξεις IGKJ-C-INTRON-KDE ενισχύθηκαν σε 26/42 περιπτώσεις (61.9%). Δεκαεννέα από τις 43 περιπτώσεις κ-ΠΜ (44.2%) που αναλύθηκαν για αναδιατάξεις IGKV-J, IGKV-KDE και IGKJ-C-INTRON-KDE έφεραν μόνο μια συμβολή IGKV-J. Ενδείξεις για διαλληλικές αναδιατάξεις του γενετικού τόπου IGK προέκυψαν σε: (ί) 17/43 περιπτώσεις (39.5%) που έφεραν μια αναδιάταξη της αλληλουχίας KDE παράλληλα με μια εκφραζόμενη αναδιάταξη IGKV-J, και (ϋ) 5/43 περιπτώσεις (9.3%) με διπλές αναδιατάξεις IGKV-J. Σαράντα δύο περιπτώσεις λ-ΠΜ αναλύθηκαν για αναδιατάξεις IGKV-J, IGKV-KDE και IGKJ-C-INTRON-KDE. Μόνο σε έξι περιπτώσεις (14.3%) δεν υπήρξαν ενδείξεις για αναδιάταξη του γενετικού τόπου IGK. Δεκαοκτώ περιπτώσεις έφεραν μια αναδιάταξη στο γενετικό τόπο IGK, ενώ 12 και 6 περιπτώσεις, αντιστοίχως, έφεραν δύο ή τρεις αναδιατάξεις στο γενετικό τόπο IGK. Στις υπόλοιπες περιπτώσεις (14/18) συγκεντρώθηκαν ενδείξεις για διαλληλικές αναδιατάξεις του γενετικού τόπου IGK. Ολα τα IF μετάγραφα IGKV-J στο κ-ΠΜ είχαν ομολογία που κυμαινόταν από 84% έως 98%. Στο λ-ΠΜ, έξι από τις 19 αναδιατάξεις IGKV-J είχαν ομολογία < 100%: 3/6 μεταλλαγμένες περιπτώσεις είχαν ομολογία < 98%. Συνεπώς, τα νεοπλασματικά κύτταρα του ΠΜ έχουν επιλεγεί θετικά κατά την ανάπτυξη στο βλαστικό κέντρο. Η έκταση του φαινομένου της σωματικής υττερμεταλλαξιγένεσης είναι μεγαλύτερη στο Π Μ σε σχέση ττρος την ΧΛΛ.