Μεταδιαφοροποιητικές και ανοσορρυθμιστικές ιδιότητες των μεσεγχυματικών κυττάρων του μυελού των οστών στην πειραματική αρθρίτιδα

Abstract

The recently recognized potential of mesenchymal stromal cells (MSCs) to differentiate into a broad spectrum of tissues and to act as immune regulators has emerged intense research interest on their possible use in a wide range of clinical entities. Although the immunoregulatory potential of MSCs has been shown to effectively control Graft versus Host Disease (GvHD) in several clinical studies, their role in autoimmune diseases has not been extensively explored. It has been reported that MSCs can ameliorate autoimmune encephalomyelitis, lupus erythematosus, diabetes mellitus and autoimmune enteropathy in experimental models. However, their potential to treat rheumatoid arthritis (RA) has been thus far contradictory. The aim of the present thesis was to explore the effect of bone marrow MSCs in two animal models resembling human RA: adjuvant-induced arthritis (AIA) and spontaneously erosive arthritis (SEA). There was a clear discrepancy between the in vitro and in vivo immunosuppressive function of MSCs in AIA. In vitro, MSCs targeted two critical cell populations of RA: MSCs inhibited the proliferation of arthritic splenocytes (SPLCs) and the proliferation and invasiveness of arthritic fibroblast-like synoviocytes (FLS). In contrast, there was no clinical benefit when MSCs were administered in AIA, unless they were infused before the arthritis onset, an effect which cannot be clinically translated. Similarly, MSCs did not ameliorate SEA also, thus the hypothesis that TLR ligands present in the adjuvant used for arthritis induction potentially polarize MSCs towards a pro-inflammatory phenotype abrogating their immunomodulatory function, could not interpret their in vivo inefficiency. The observed discrepancy between the in vitro and in vivo function of MSCs strongly implicates the inflammatory microenvironment of arthritis as an inhibitory condition for the immunosuppressive effects of MSCs. An additional goal of this doctoral thesis was to investigate strategies which could overcome or attenuate the highly RA inflammatory milieu in order to circumvent the limitations of the in vivo MSC performance in RA. Towards this goal, we showed that cytokine- activated MSCs (either with IFN-γ or with combination of IFN-γ and TNF-α) were also ineffective in AIA. Subsequently, we investigated whether the proteasome inhibitor, Bortezomib (Bzb) which has been approved for clinical use in the treatment of multiple myeloma, could serve as a new therapeutic approach for RA. Bzb inhibits NF-κB and through it, important inflammatory mediators (TNF-α, IL-6, V-CAM-1), involved in inflammatory and autoimmune conditions such as RA. Our findings suggest that Bzb affects AIA in a pleiotropic manner. In vitro, Bzb exerted antiproliferative and proapoptotic effects in SPLCs and FLS from rats with AIA. In addition, Bzb reduced the invasiveness of FLS from rats with AIA and modified the pattern of cytokine secretion in cultured SPLCs. In vivo, Bzb markedly ameliorated AIA even when administered during advanced disease phase. The clinical remission was also histologically confirmed and it was associated with decreased T lymphocyte, B lymphocyte, and macrophage cell infiltration, decreased expression of cyclooxygenase 1 (COX-1) and reduced vessel density compared with control animals. Bzb improved bone disease in CT images and restored the increased expression of TLR-2, TLR-3 and TLR-4 in PB or in cultured FLS from treated animals. Although Bzb drastically affects AIA, the narrow therapeutic window observed in treated animals with AIA, the cytotoxicity of the drug at high concentrations and the need for repeated treatment in chronic diseases such as RA, raise safety concerns about its clinical use in RA. However, a short Bzb-course could temporarily alleviate the inflammatory milieu of experimental arthritis allowing MSCs to act immunosuppressively. Indeed, we demonstrated that Bzb+MSCs-treated animals presented significantly decreased clinical and histological arthritis score over AIA-, MSCs-alone- and Bzb-alone-treated animals. The Bzb+MSCs combination increased in vivo the blood T-regulatory cells (Tregs) and restored the proliferation and apoptosis of SPLCs, the cytokine secretion pattern in the supernatant of SPLCs and the expression of TLRs in blood. Conclusively, the results of this doctoral thesis suggest that MSCs could be effective in RA only under conditions that form a permissive microenvironment. In this setting, a short Bzb-course alters the inflammatory milieu of experimental arthritis allowing MSCs to exert their immunomodulatory function and significantly ameliorate the disease. It is our belief, that either Bzb or the combination of Bzb+MSCs are worth exploring in a clinical setting and that they potentially represent significant future treatment strategies for RA.

Οι πρόσφατα αναγνωρισμένες ιδιότητες των μεσεγχυματικών στρωματικών κυττάρων (MSCs) να μπορούν να διαφοροποιούνται προς ένα ευρύ φάσμα κυττάρων και να δρουν ανοσορρυθμιστικά έχουν εγείρει έντονο ερευνητικό ενδιαφέρον για την πιθανή χρήση τους σε ποικίλες κλινικές οντότητες. Αν και αρκετές κλινικές έρευνες έχουν καταδείξει αποτελεσματικό έλεγχο της νόσου του μοσχεύματος κατά ξενιστή (GvHD) με χορήγηση MSCs, η δράση τους σε καταστάσεις αυτοανοσίας δεν έχει ιδιαίτερα διερευνηθεί. Έχει αναφερθεί ότι τα MSCs μπορούν να βελτιώσουν την αυτοάνοση εγκεφαλομυελίτιδα, τον ερυθηματώδη λύκο, το σακχαρώδη διαβήτη και την αυτοάνοση εντεροπάθεια σε ζωικά μοντέλα. Ωστόσο, ο ρόλος τους στη ρευματοειδή αρθρίτιδα (ΡΑ) παραμένει αντικρουόμενος. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η διερεύνηση της επίδρασης των MSCs μυελού των οστών σε πειραματικό μοντέλο αρθρίτιδας επίμυων (ΠΑ) και αυθόρμητο μοντέλο αρθρίτιδας ποντικών (ΑΥ-Α). Και τα δύο αυτά ζωικά μοντέλα προσομοιάζουν στη ΡΑ του ανθρώπου. Διαπιστώθηκε αναντιστοιχία μεταξύ της in vitro και της in vivo ανασταλτικής δράσης των MSCs στην ΠΑ. In vitro, τα MSCs ανέστειλαν ιδιαίτερης σημασίας κυτταρικούς υποπληθυσμούς στη ΡΑ. Συγκεκριμένα, ανέστειλαν τον πολλαπλασιασμό των αρθριτικών σπληνοκυττάρων (SPLCs) και τη διεισδυτική και πολλαπλασιαστική ικανότητα των αρθριτικών συνοβιοκυττάρων (FLS). Σε αντίθεση, in vivo, τα MSCs δεν απέφεραν κανένα αποτέλεσμα στην ΠΑ παρά μόνο όταν χορηγήθηκαν πριν από την εμφάνιση της αρθρίτιδας, δράση η οποία δε μπορεί να μεταφραστεί κλινικά. Η αναποτελεσματικότητά τους αυτή δε φάνηκε να σχετίζεται με την παρουσία αγωνιστών των Toll-like receptors (TLRs) στα συστατικά του ανοσοενισχυτικού που χρησιμοποιείται για την επαγωγή της ΠΑ, οι οποίοι πιθανόν να εκτρέπουν τα MSCs προς ένα προ-φλεγμονώδη φαινότυπο, καθώς η χορήγηση MSCs δε βελτίωσε ούτε την ΑΥ-Α. Η αναντιστοιχία αυτή μεταξύ της in vitro και in vivo δράσης των MSCs ενοχοποιεί ισχυρά το έντονα φλεγμονώδες περιβάλλον της αρθρίτιδας ως παράγοντα αναστολής των ανοσοκατασταλτικών ιδιοτήτων των MSCs. Απώτερος στόχος της διατριβής, ήταν η διερεύνηση στρατηγικών που μπορούν να παρακάμψουν ή να καταστείλουν το έντονα φλεγμονώδες μικροπεριβάλλον στη ΡΑ, ώστε να αρθούν οι περιορισμοί που μπλοκάρουν την αποτελεσματικότητα των MSCs. Στο πλαίσιο διερεύνησης τέτοιων στρατηγικών άρσης των μηχανισμών που μπορεί να καταστέλλουν in vivo τη δράση των MSCs, διαπιστώθηκε ότι η ενεργοποίηση των MSCs με κυτοκίνες (IFN-γ ή συνδυασμό IFN-γ και TNF-α), δε βελτίωσε την απόδοσή τους. Ακόλουθα, διερευνήθηκε εάν ο αναστολέας του πρωτεασώματος Bortezomib (Bzb), που έχει εγκριθεί για κλινική χρήση στο πολλαπλό μυέλωμα, θα μπορούσε να αποτελέσει θεραπευτική επιλογή για τη ΡΑ. Το Bzb προκαλεί αναστολή της δράσης του NF-κB και κατά συνέπεια αναστολή της μεταγραφής σημαντικών διαμεσολαβητών της φλεγμονής (TNF-α, IL-6, V-CAM-1) που εμπλέκονται σε φλεγμονώδεις και άνοσες καταστάσεις, όπως η ΡΑ. Διαπιστώθηκε ότι το Bzb μπορεί να επιδράσει πλειοτροπικά στην ΠΑ. In vitro, προκάλεσε σημαντική αναστολή του πολλαπλασιασμού καθώς και προ-αποπτωτική δράση σε SPLCs και FLS αρθριτικών ζώων. Επιπρόσθετα, το Bzb μείωσε τη διεισδυτική ικανότητα των αρθριτικών FLS και τροποποίησε το προφίλ των εκκρινόμενων κυτοκινών των SPLCs. In vivo, το Bzb βελτίωσε θεαματικά την αρθρίτιδα ακόμη και επί εγκατεστημένης νόσου. Η κλινική βελτίωση επιβεβαιώθηκε ιστολογικά και σχετίστηκε με μειωμένη διήθηση Β- λεμφοκυττάρων, Τ-λεμφοκυττάρων και μακροφάγων, μείωση της αγγειογένεσης και ελαττωμένη έκφραση της κυκλοοξυγενάσης-1 στις αρθρώσεις των Bzb- ζώων. Το Bzb βελτίωσε απεικονιστικά την οστική νόσο, επανέφερε σε φυσιολογικά επίπεδα την αυξημένη έκφραση των TLR-2, TLR-3 και TLR-4 στο αίμα και στα FLS των Bzb- ζώων. Παρά την εντυπωσιακή δράση του Bzb στην ΠΑ, το στενό θεραπευτικό παράθυρο ως προς τη δόση που είναι ασφαλής αλλά και αποτελεσματική, η ανάγκη για χρόνια χορήγηση για διατήρηση του θεραπευτικού αποτελέσματος, καθώς και κάποιες ανεπιθύμητες δράσεις του (περιφερική νευροπάθεια, θρομβοπενία) γνωστές από τη χρήση του στο πολλαπλό μυέλωμα, μπορεί να αποτελέσουν περιορισμούς για την κλινική χρήση του στη ΡΑ. Ωστόσο, μία μικρής διάρκειας προ-θεραπεία με Bzb θα μπορούσε να μεταβάλλει προσωρινά το φλεγμονώδες μικροπεριβάλλον της ΡΑ ώστε να επιτρέψει στα χορηγούμενα MSCs να ασκήσουν τις ανοσοκατασταλτικές τους ιδιότητες. Πράγματι, δείξαμε ότι τα ζώα που έλαβαν προ-θεραπεία με Bzb και στη συνέχεια έλαβαν MSCs, εμφάνισαν σημαντική κλινική και ιστολογική βελτίωση σε σχέση με την ομάδα ελέγχου, ομάδα μόνο-Bzb και ομάδα μόνο-MSCs. Η θεραπευτική δράση του συνδυασμού Bzb+MSCs σχετίστηκε με αύξηση των T-ρυθμιστικών κυττάρων (Tregs) στο αίμα, αποκατάσταση στο φυσιολογικό του πολλαπλασιασμού και της απόπτωσης των SPLCs, των επιπέδων των κυτοκινών σε καλλιέργειες SPLCs, καθώς και των επιπέδων έκφρασης των TLRs στο αίμα. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής προτείνουν ότι τα MSCs μπορούν να είναι δραστικά στη ΡΑ μόνο κάτω από συνθήκες που διαμορφώνουν ένα επιτρεπτικό μικροπεριβάλλον. Στο πλαίσιο αυτό, η μικρής διάρκειας προ-θεραπεία με Bzb, τροποποιεί το φλεγμονώδες μικροπεριβάλλον της αρθρίτιδας επιτρέποντας στα MSCs να ασκήσουν τις ανοσορρυθμιστικές τους ιδιότητες και να βελτιώσουν σημαντικά τη νόσο. Πιστεύουμε ότι το Bzb ή ο συνδυασμός Bzb+MSCs μπορεί να αποτελέσουν στο μέλλον σημαντικές θεραπευτικές επιλογές για τη ΡΑ και αξίζει να δοκιμαστούν κλινικά.