Έλεγχος μεταλλάξεων του γονιδίου p27 σε ασθενείς με χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία

Abstract

B-CLL is characterized by the accumulation of resting lymphocytes. The cyclin-dependent kinase (cdk) inhibitor p27, inhibiting all cdk complexes, contributes to cell cycle arrest. High p27 protein expression has been reported in B-CLL correlating with poor prognosis. The aim of the present study was to determine the frequency of rearrangements and point mutations of the coding region of p27 gene in B-CLL.Methods:DNA was extracted from peripheral blood mononuclear cells of 35 patients with B-CLL. P27 gene rearrangements were studied by Southern blot. DNA was digested with EcoR1 and Hind III. The probe used was the PCR product of exon 1 p27 gene amplification, labeled with a32PdCTP (Multiprime DNA labeling protocol, Amersham). Mutational analysis was performed using a radioactive PCR-SSCP method. P27 exons 1 and 2 were amplified from 100ng of DNA using a32PdCTP for labeling. Electrophoresis of radiolabelled products was performed on a 0.5XMDE gel (MSDS, AT Biochem) at room temperature in 0.6TBE Buffer for 14 hours. Samples with altered migration pattern by SSCP were sequenced directly using the double-strand DNA Cycle Sequencing System. All amplified exons were sequenced in both sense and antisense direction.Results:The Southern analysis revealed non rearranged bands in 33/35 cases. Homozygous deletions were not observed. In 2/35 cases rearranged bands were detected with EcoR1 and Hind III enzymes. These cases included one with stage C and one with stage A disease.The PCR SSCP analysis of exon 2 detected normal pattern of migration in all cases. The analysis of exon 1 revealed abnormal migration pattern in 4/35 cases. One of those had stage C disease and presented a rearranged p27 band on Southern analysis also. Two cases had stage B and 1 stage A disease. Sequencing analysis of these cases showed that in this patient a previously described polymorphism was found in exon 1. This polymorphism represents a base substitution at codon 115 (GCGGCA) that results in no amino acid change A[Ala]A[Ala].Conclusion: P27 gene rearrangements were observed in B-CLL at a low frequency: 2/35(5.7%) of cases. Point mutations were detected by PCR SSCP screening in 4/35(11.4%) of the cases in the first exon of p27 gene. Sequencing of these cases revealed the presence of the ALA115ALA polymorphism. In conclusion these results indicate that CDKN1B might be rarely mutated in Chronic Lymphocytic Leukemia.

Κατά την μελέτη του γονιδίου p27 σε ασθενείς Χρόνια Λεμφοκυτταρική Λευχαιμία δεν διαπιστώθηκαν ελλείμματα ή σημειακές μεταλλάξεις του γονιδίου. Η μελέτη έγινε με βάση την τεχνική Southern blotting, PCR-SSCP αλλά και ανάλυση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας ύποπτων ασθενών. Αναδιατάξεις του P27 γονιδίου σε Β-ΧΛΛ ασθενείς παρατηρήθηκαν σε χαμηλή συχνότητα: 2/35 (5,7%) των περιπτώσεων. Η ανάλυση του 2ου εξωνίου με PCR SSCP έδειξε φυσιολογική εικόνα κατά την ηλεκτροφόρηση. Η ανάλυση του 1ου εξωνίου έδειξε επιπρόσθετες μπάντες κατά την ηλεκτροφόρηση σε 4 περιπτώσεις 4/35(11.4%). Η ανάλυση αλληλουχιών που ακολούθησε δεν επιβεβαίωσε μεταλλάξεις του γονιδίου εκτός από έναν πολυμορφισμό σε έναν μόνο ασθενή. Η βιολογική και κλινική σημασία αυτών των αλλοιώσεων μένει να αποσαφηνιστεί σε μελλοντικές μελέτες.Τα αποτελέσματα αυτά βρίσκονται σε συμφωνίας με αντίστοιχα αποτελέσματα άλλων μελετών που υποστηρίζουν ότι το γονίδιο p27Kip1 δεν είναι ένας συχνός στόχος μεταλλάξεων που προδιαθέτουν σε καρκίνο. Υπάρχουν μια σειρά από ανεξάρτητες ανακοινώσεις [374, 375], που έχουν δείξει την απουσία μεταλλάξεων του p27, σε μια σειρά από καρκίνους. Ωστόσο, το p27 ενεργεί σαν στοιχειομετρικός αναστολέας των G1-cyclin-cdks και ακόμα και μικρές αλλαγές στα σχετικά επίπεδα του p27 μπορούν να έχουν σημαντική επίδραση στην εξέλιξη στην G1 φάση [376]. Άρα είναι πιθανό ότι μετα-μεταγραφικές ή μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, ή ακόμα και τροποποιημένο πρότυπο έκφρασης του p27, μπορεί να συμβάλει στη διεργασία της ογκογένεσης. Εναλλακτικά, άλλα γονίδια με τα προϊόντα αποκωδικοποίησής τους που επηρεάζουν ενισχυτικά ή κατασταλτικά τον p27 μηχανισμό δράσης, μπορεί να ευθύνονται για συγκεκριμένους καρκίνους.