Ακινητοποίηση ακετυλοχολινεστεράσης σε νανοπορώδη υλικά για την ανάπτυξη βιοαισθητήρα οργανοφωσφορικών παρασιτοκτόνων

Abstract

The scope of the project was the development of a biosensor system of improved analytical characteristics, with emphasis on the stability and the sensitivity. In order to achieve this goal, two approaches would be employed: The use of novel nanomaterials for the design of the biosensor system and the application of genetically engineered enzymes of improved catalytic properties.The main prerequisites for the design of a reliable and sensitive biosensor system are the simple immobilization procedure and the establishment of fast transduction of the analytical information to electrical signal and these characteristics also determine the choice of nanomaterials to be employed. Previous studies in our laboratory as well as extensive literature search indicated that the most appropriate materials for the development of electrochemical biosensors were porous materials with pore diameter in the range of nanometers. The following materials were chosen for further study: Nano-porous carbon. The porous carbon has an extensive porous structure thatallows the immobilization of high enzyme amount, by a simple single-step adsorption procedure. Additionally, its high conductivity allows its use as a transduction platform for amperometric measurements. The stabilizing effect of this material to highly unstable enzymes was evaluated and studied. Porous sol-gel polymers. Sol-gels were chosen as immobilization matrices, due totheir tunable physicochemical characteristics and their simple synthetic procedure. The material was optimized for enzyme immobilization in order to obtain a biosensor of enhanced sensitivity.It was decided that both the porous carbon and the sol-gels would be used for the development of a biosensor to detect organophosphorus pesticides. Organophosphorus pesticides constitute one of the most toxic classes of compounds that threaten public health. Their extensive and inappropriate use has rendered their reliable monitoring at trace levels more and more necessary. In order to achieve the lowest possible detection limits and the highest sensitivity, it was also decided toevaluate an appropriately genetically engineered enzyme. Carbon nanotubes. Carbon nanotubes have a wide range of properties that make them extremely promising immobilization matrices for electrochemical biosensors, such as their high surface ratio, the possibility for functionalization and their electron transfer properties. At the same time they can act as transduction platforms due to their high conductivity while their nanometer size can lead to the development of nano-biosensors. In order to examine all of the above properties of carbon nanotubes it was mandatory to immobilize an enzyme that performs oxidation and reduction reactions. Therefore, Glucose oxidase was chosen since the development of a glucose biosensor is of high clinical interest.

Στόχος της παρούσας εργασίας ήταν ο σχεδιασµός και η ανάπτυξη συστηµάτων βιοαισθητήρων µε βελτιστοποιηµένα αναλυτικά χαρακτηριστικά, µε έµφαση στη σταθερότητα και την ευαισθησία. Για την επίτευξη του στόχου αυτού αποφασίστηκε να γίνει σχεδιασµός νέων βιοαισθητήρων βασισµένων σε νανο-υλικά. Η επιλογή των υλικών έγινε µε στόχο το σχεδιασµό ενός βιοαισθητήρα µε απλή διαδικασία ακινητοποίησης του βιολογικού µορίου και γρήγορη µετατροπή τηςβιολογικής αναγνώρισης σε ηλεκτρικό σήµα. Προηγούµενες µελέτες του εργαστηρίου στην ανάπτυξη βιοαισθητήρων αλλά και επισταµένη βιβλιογραφική έρευνα, έδειξαν ότι τα καταλληλότερα υλικά για το σκοπό αυτό ήταν τα νανο-πορώδη υλικά. Έτσι, µελετήθηκαν τα ακόλουθα υλικά: Νανο-πορώδης άνθρακας. Ο πορώδης άνθρακας επιτρέπει την ακινητοποίηση υψηλού ενζυµικού φορτίου µε απλή προσρόφηση. Παράλληλα, πρόκειται για ένα υλικό αγώγιµο που επιτρέπει την ταυτόχρονη χρήση του και ως αµπεροµετρικού µεταλλάκτη σήµατος. Αποφασίστηκε να γίνει αξιολόγηση του υλικού ωςµεταλλάκτη σήµατος αλλά και ως υλικού ακινητοποίησης και σταθεροποίησης ενζύµων. Πορώδεις πυριτικές πηκτές (sol-gel). Τα υλικά αυτά επελέγησαν λόγω της ποικιλίας των φυσικοχηµικών τους ιδιοτήτων και της απλής συνθετικής διαδικασίας τους. Τα χαρακτηριστικά αυτά δίνουν τη δυνατότητα να µελετηθεί και να βελτιστοποιηθεί το υλικό για την ακινητοποίηση του ενζύµου, γεγονός που αναµένεται να οδηγήσει σε βιοαισθητήρες µε αυξηµένη ευαισθησία. Τα δύο αυτά πορώδη υλικά αποφασίστηκε να χρησιµοποιηθούν για την ανάπτυξη ενός βιοαισθητήρα ανίχνευσης οργανοφωσφορικών παρασιτοκτόνων. Τα οργανοφωσφορικά παρασιτοκτόνα που αποτελούν µια περιβαλλοντική παράµετρο µεγάλης σηµασίας για τη δηµόσια υγεία και η ανάγκη ευαίσθητων συστηµάτων ανίχνευσής τους καθίσταται όλο και πιο επιτακτική. Για την µείωση των ορίωνανίχνευσης του υπό ανάπτυξη βιοαισθητήρα αποφασίστηκε να χρησιµοποιηθεί και κατάλληλα γενετικά τροποποιηµένο ένζυµο. Νανοσωλήνες άνθρακα. Οι νανοσωλήνες άνθρακα επελέγησαν λόγω του µικρού τους µεγέθους που είναι της τάξης των nm και δίνει τη δυνατότητα ανάπτυξηςνανο-αισθητήρων. Η υψηλή δραστική τους επιφάνεια αναµένεται να επιτρέψει την ακινητοποίηση υψηλού ενζυµικού φορτίου ώστε να προκύψει ένα αναλυτικό σύστηµα υψηλής ευαισθησίας. Οι νανοσωλήνες άνθρακα παρουσιάζουν ταυτόχρονα ενδιαφέρουσες ηλεκτρικές ιδιότητες. Προκειµένου να µπορέσουν να αξιολογηθούν οι ικανότητές τους για µεταφορά ηλεκτρονίων σε σύζευξη µεένζυµα, ήταν αναγκαία η ακινητοποίηση ενός οξειδοαναγωγικού ενζύµου. Επελέγη η Οξειδάση της Γλυκόζης, που χρησιµοποιείται για την ανάπτυξη βιοαισθητήρα γλυκόζης, που αποτελεί µία από τις πιο σηµαντικές κλινικές παραµέτρους.