Διαδερμική χορήγηση φαρμάκων: I) Σύγκριση διαφόρων τύπων ελαστικών λιποσωμάτων και μελέτη μηχανισμού αύξησης διαπερατότητας υδατοδιαλυτών φαρμάκων με τη χρήση τους: II) Αύξηση διαπερατότητας αντιυπερτασικών φαρμάκων με συστήματα ενισχυτών διαπέρασης

Abstract

In this study, we investigated the use of elastic liposomes in transdermal delivery ofhydrophilic substances and we studied the possibility of formulating a newantihypertensive drug for transdermal delivery.Primarily, morphological studies of human skin were conducted by the use of opticalmicroscopy and transepidermal water loss measurements (TEWL), in order to assessthe barrier function of stratum corneum (SC), and the integrity of the techniques usedin this study. By optical microscopy, in particular, data concerning the skin structureand the possible mechanism by which substances can be delivered through / into theskin, were obtained.Secondly, we studied and compared various physicochemical characteristics of twodifferent types of elastic liposomes, which could help us predict the transdermalabsorption (in vivo) of hydrophilic molecules. Fluorescent markers calcein andcarboxyfluorescein were used as hydrophilic model drugs. All liposomal dispersions(conventional liposomes CLs, and elastic liposomes i.e. transfersomes TRs andinvasomes INVs) were evaluated in means the following physicochemical properties:size distribution, z-potential, stability upon storage, morphology by cryo-electronmicroscopy and membrane elasticity. Moreover, their ability to encapsulate and alsoto retain aqueous soluble markers, was investigated. Finally, the permeation of calceinthrough human skin was tested and compared by use of elastic and conventional rigidliposomes. The mean diameter was found relatively homogenous, similar for mostliposomal dispersions, while the addition of different penetration enhancers during thepreparation did not influence z-potential. Increase of size average and instability – asfar as the retention of the encapsulated substance is concerned – was observed athigher concentrations of penetration enhancers used. Sodium cholate containing TRswere found more elastic compared to Tween 80 containing TRs, which showedrelatively low elasticity values (<40mg/s·cm2). The highest elasticity values among alltypes of elastic liposomes prepared, were found in the case of INVs with 1%w/w PEand 1% w/w LIM. Furthermore, most INVs showed higher elasticity values comparedto the ones without terpenes (control INVs), except from citral and cineol INVs,where elasticity decreased compared to the control ones.It appears that different types of liposomes can alter fluorescent permeation in thefollowing order: Solution<CLs<TRs<<INVs. Permeability, flux and enhancement ratio (ER) show that conventional liposomes increased slightly calcein flux, whileTRs and INVs 1.8 and 7.2 times respectively. These findings confirm the fact that CLsare inefficient drug delivery systems for water soluble molecules through human skin,and show that elastic liposomes having the highest elasticity value are more efficientin delivering CF transdermally.In further experiments, the penetration of both hydrophilic and lipophilic molecules inhuman skin was studied, in order to investigate the mechanism of action by whichliposomes could enhance the drug delivery in skin. Fluorescent marker calcein wasused as a hydrophilic drug model, while lipid rhodamine-PE was used as a lipophilicmodel (it shows us how deeply the liposomes penetrate into the skin).Liposomes TRs seem to enhance skin permeation by helping the marker to penetrate(through liposomes) in deeper stratum corneum layers while conventional liposomesthe hydrophilic substance which penetrates the skin layers as a free molecule. Incontrast, INV liposomes were proved to be able to penetrate in deeper skin layers, anddeliver relatively high amounts of the encapsulated substance.In the end, experiments with a new molecule with similar structure to losartan wereconducted. This study aimed at discovering a new formulation for this experimentaldrug in order to be used as a transdermal antihypertensive. First, we studied thephysicochemical properties (solubility in PBS, BSA etc, and protein binding).Secondly, we investigated the possibility of preparing a formulation to be usedtransdermally. After establishing the techniques and drug properties we usedpenetration enhancers in order to increase the transdermal absorption as possible andhelp find the right skin formulation.Last, we compared the experimental drug and losartan in terms of physicochemicalproperties and their ability to be transported through human skin. The results showedthat the experimental drug had better permeation rate as a neutral molecule comparedto TFA salt, (as shown in preliminary experiments) or K+ (as shown after comparing Pand flux values). Therefore, the values given for the neutral molecule should be takeninto consideration when comparing the two drugs. (losartan and experimental drug).The permeation of the neutral molecule nevertheless is significantly lower than theone for losartan.

Στην παρούσα διατριβή, µελετήθηκε η χρήση ελαστικών λιποσωµάτων στηδιαδερµική χορήγηση υδατοδιαλυτών ουσιών και πραγµατοποιήθηκαν επίσης µελέτεςπρο-µορφοποίησης αντιϋπερτασικών βιοδραστικών ενώσεων για διαδερµικήχορήγηση.Αρχικά, πραγµατοποιήθηκαν µελέτες της φυσιολογίας του δέρµατος µε τεχνικέςµικροσκοπίας και µέτρησης της απώλειας ύδατος µέσω της επιδερµίδας (TEWL) µεσκοπό να διαπιστωθεί η λειτουργία του φραγµού της κεράτινης στοιβάδας, καθώςκαι η ορθότητα χρήσης των σχετικών τεχνικών προετοιµασίας των δειγµάτωνδέρµατος που χρησιµοποιήθηκαν. Η οπτική µικροσκοπία ειδικά µας έδωσεπληροφορίες ως προς τη δοµή της επιδερµίδας και ως προς τον πιθανό µηχανισµόµεταφοράς ουσιών µέσω της χρήσης λιποσωµάτων.Στη συνέχεια πραγµατοποιήθηκε µελέτη και σύγκριση των διαφόρων φυσικοχηµικώνχαρακτηριστικών ελαστικών λιποσωµάτων που µπορεί να χρησιµοποιηθούν ωςπρώτοι δείκτες για πρόγνωση της διαδερµικής απορρόφησης (in vivo) των υδρόφιλωνβιοδραστικών ενώσεων. Ως µοντέλα υδρόφιλων βιοδραστικών ενώσεωνχρησιµοποιήθηκαν οι φθορίζουσες χρωστικές καλσεΐνη και καρβοξυφλουορεσκεΐνη.Όλες οι λιποσωµικές διασπορές (τόσο τα συµβατικά λιποσώµατα-CLs, όσο και ταελαστικά λιποσώµατα τύπου transfersome-TRs και τύπου invasomes-INVs)χαρακτηρίστηκαν ως προς τα εξής φυσικοχηµικά χαρακτηριστικά: Την κατανοµήµεγέθους, το ζ-δυναµικό, το σφαιρικό σχήµα και τη µορφολογία τους, την ικανότηταεγκλωβισµού υδρόφιλων ουσιών, τη σταθερότητά τους (ως προς τα µορφολογικάχαρακτηριστικά, τη διασπορά µεγέθους και το φορτίο επιφανείας, και τη συγκράτησητης εγκλωβισµένης σε αυτά ουσίας) σε σχέση µε το χρόνο, την ελαστικότητα καιτέλος ως προς τη δυνατότητα διαπέρασης εγκλωβισµένων σε αυτές υδρόφιλωνουσιών µέσω ανθρώπινου δέρµατος in vitro. Το µέγεθος των λιποσωµάτων ήτανπαρόµοιο και αρκετά οµοιογενές, ενώ η προσθήκη διαφορετικών τύπων ενισχυτικώνδιαπέρασης στα ελαστικά λιποσώµατα, στα συνήθη εύρη συγκεντρώσεων πουχρησιµοποιούνται, δεν επηρεάζει καθόλου το επιφανειακό φορτίο των παραχθέντωνλιποσωµάτων. Αύξηση του µεγέθους και αστάθεια ως προς τη συγκράτηση τηςεγκλωβισµένης ουσίας παρατηρήθηκε στην περίπτωση προσθήκης µεγαλύτερηςποσότητας ενισχυτικού διαπέρασης, η οποία αλλάζει και τα φυσικοχηµικάχαρακτηριστικά των λιποσωµάτων. Τα TRs που περιείχαν χολικό νάτριο ήταν πιο ελαστικά από τα αντίστοιχα µε Tween 80, τα οποία είχαν συγκριτικά χαµηλές τιµέςελαστικότητας (<40mg/s·cm2). Οι υψηλότερες τιµές ελαστικότητας από όλους τουςτύπους ελαστικών λιποσωµάτων που παρασκευάστηκαν στα πλαίσια αυτής τηςδιατριβής, παρατηρήθηκε στην περίπτωση των INVs µε 1% w/w PE και 1% w/wLIM. Επιπλέον, τα περισσότερα λιποσώµατα τύπου INVs είχαν υψηλότερες τιµέςελαστικότητας σε σχέση µε τα αντίστοιχα χωρίς τερπένια (INVs αναφοράς), εκτόςαπό την περίπτωση των INVs µε citral και cineol, όπου η ελαστικότητα σηµείωσεµείωση σε σχέση µε τα INVs χωρίς τερπένια.Οι διάφοροι τύποι λιποσωµάτων φαίνεται να µεταβάλλουν τη διαπέραση τηςχρωστικής µε την εξής σειρά: ∆ιάλυµα<CLs<TRs<<INVs. H διαπερατότητα(permeability), η ροή (flux) και ο λόγος προσαύξησης (ER) δείχνουν ότι τασυµβατικά λιποσώµατα αύξησαν ελάχιστα τη ροή της καλσεΐνης, ενώ τα TRs καιINVs κατά 1.8 και 7.2 φορές, αντίστοιχα. Τα αποτελέσµατα αυτά επιβεβαιώνουν τογεγονός ότι τα συµβατικά λιποσώµατα είναι ανεπαρκή συστήµατα µεταφοράςυδρόφιλων µορίων µέσω του δέρµατος, ενώ παράλληλα δείχνουν ότι τα ελαστικάλιποσώµατα µε τη µεγαλύτερη τιµή ελαστικότητας είναι πιο αποτελεσµατικά στηµεταφορά της ουσίας µέσω του δέρµατος.Σε επόµενα πειράµατα µελετήθηκε η δυνατότητα διείσδυσης τόσο υδρόφιλων όσο καιλιπόφιλων µορίων στις στοιβάδες του δέρµατος, σε µια προσπάθεια να διερευνηθεί οµηχανισµός αύξησης της διαδερµικής διαπέρασης των υδρόφιλων χρωστικών απότους διάφορους τύπους ελαστικών λιποσωµάτων. Ως µοντέλο υδρόφιλης ουσίαςχρησιµοποιήθηκε η φθορίζουσα χρωστική καλσεΐνη, ενώ η λιπιδική ροδαµίνηχρησιµοποιήθηκε ως µοντέλο λιπόφιλης ουσίας (που δεν φεύγει από τα λιποσώµατακαι ουσιαστικά µας δείχνει το βάθος εις το οποίο εισχωρούν µέσα στο δέρµα τααντίστοιχα είδη λιποσωµάτων).Τα λιποσώµατα τύπου TR φαίνεται ότι επάγουν τη διαπέραση µε το να βοηθούν τηχρωστική να προχωρά (υπό µορφή λιποσωµάτων που την εγκλωβίζουν) σε βαθύτεραστρώµατα της κεράτινης στιβάδας σε σχέση µε τα συµβατικά λιποσώµατα όπου σεµεγάλο ποσοστό διαρρηγνύονται και απελευθερώνουν την υδρόφιλη ουσία η οποίαστη συνέχεια διέρχεται µόνη της, ως ελεύθερο µόριο, στις στιβάδες του χορίου.Αντίθετα, τα λιποσώµατα τύπου INV αποδείχτηκε ότι εισδύουν σε βαθύτερεςστιβάδες της επιδερµίδας, φθάνοντας σε αρκετά υψηλά ποσοστά σε στιβάδες του χορίου, παρασύροντας µαζί τους και τα µόρια του εγκλωβισµένου σε αυτά υδρόφιλουφαρµάκου.Τέλος, µελετήθηκε η δυνατότητα µορφοποίησης ενός πειραµατικού φαρµάκου µεανάλογη δοµή γνωστού φαρµάκου προκειµένου για διαδερµική αντιϋπερτασικήθεραπεία. Αρχικά, µελετήσαµε το πειραµατικό φάρµακο ως προς τις φυσικοχηµικέςτου ιδιότητες (διαλυτότητα σε διάφορα µέσα, σύνδεση µε πρωτεΐνες) και στησυνέχεια µελετήσαµε τη δυνατότητα χορήγησης µιας φαρµακοτεχνικής µορφής µέσωτου δέρµατος σε κατάλληλο σύστηµα διαλυτών. Αφού βρέθηκαν οι κατάλληλεςσυνθήκες, χρησιµοποιήθηκαν ενισχυτικά διαπέρασης στη φαρµακοτεχνική µορφή γιανα επιταχυνθεί η διαδερµική απορρόφηση του φαρµάκου, όσο είναι δυνατόν, και ναευρεθεί η βέλτιστη φαρµακοτεχνική µορφή.Τέλος, πραγµατοποιήθηκαν πειράµατα σύγκρισης µεταξύ του πειραµατικούφαρµάκου και γνωστού αντιϋπερτασικού (Los) ως προς τις φυσικοχηµικές ιδιότητεςκαι την ικανότητα µεταφοράς τους διαδερµικά. Τα αποτελέσµατα έδειξαν ότι το ΠΦπαρουσίασε µεγαλύτερη διαπέραση υπό µορφή ουδέτερου µορίου (σε σχέση µε τηναντίστοιχη του άλατος µε TFA (όπως φάνηκε από τα αρχικά πειράµατα αυτής τηςσειράς) ή του µετά Καλίου άλατος (όπως προκύπτει µετά από σύγκριση τωνσχετικών τιµών Ροής και Συντελεστή ∆ιαπερατότητας (P). Συγκρίνοντας λοιπόν τιςτιµές διαπερατότητα και ροής διαµέσου ανθρώπινης επιδερµίδας µε τις αντίστοιχεςτιµές του φαρµάκου Los θα πρέπει να λάβουµε υπ’ όψη και τις τιµές για το ουδέτεροµόριο. Η διαπέραση του ουδέτερου µορίου του ΠΦ είναι σηµαντικά χαµηλότερη απότην αντίστοιχη του µετά καλίου άλατος της los.