Η επίδραση του τραυματισμού και της μηχανικής καταπόνησης στον μηχανισμό ωρίμανσης των καρπών ακτινιδιάς

Abstract

Mechanical stress of kiwifruits (Actinidia chinensis var. deliciosa (A.Chev.) A. Chev.) is a very common phenomenon which is directly related to fruit quality and postharvest losses. Although of major importance, the knowledge regarding the role of mechanical stresses in kiwifruit metabolism is very limited. Ιn the present study, the post-harvest effect of wounding in 'Hayward' kiwifruit variety was investigated using high-throughput molecular analyzes such as metabolomics and transcriptomics. Two experimental approaches were used that reflect two different types of injury/stress. In the first experimental approach, after harvest, fruits were artificially injured by inserting a needle to a depth of one centimeter and their ripening characteristics were evaluated for the period of 8 days of ripening at room temperature. According to the results, wounding promoted fruit ripening, as demonstrated by changes in fruit firmness, ethylene production and respiration activity determined periodically during a ripening period of 8 days at room temperature. Calcium imaging using fluorescent probe Fluo-3 AM revealed spatial dynamics of Ca2+ signaling in the wounding area following 8 days of ripening. Several sugars including fructose, glucose, and sucrose as well as organic acids such as citric, succinic and galacturonic acid were increased by wounding. Gene expression analysis of the wounded fruit showed increased expression of genes that mainly involved in defense response, calcium ion binding, TCA cycle, sugars, secondary metabolism, lipid processing and pectin degradation, as well as in ethylene and auxin synthesis. Moreover, genes related to aquaporins, were down-regulated in fruit exposed to wounding. In the second experimental approach, compression force (147.1 N) was applied, during harvest as well as after short (14 days) or long (3 months) cold storage (0℃). Using several experimental approaches, we documented that the applied compression-imposed stress conditions and induced the fruit ripening process at room temperature (20℃). Fluorescent antibody labeling showed that arabinogalactan proteins and xyloglucans were altered due to compression, while gel diffusion assay indicated that pectin methylesterase activity was reduced by the long cold exposure. Intracellular Fluo-3 AM-dependent Ca2+ signals were detected in proximal to the main compressed fruit areas just after mechanical treatment. Several primary metabolites changed in cold stored pericarp and placenta tissues after 8 hours of compression treatment while transcriptomic data, also, disclosed numerous genes, which are mainly involved in sugar metabolism, TCA cycle, cell wall, ethylene and hormones signaling, that were affected by mechanical stress in pericarp and especially in placenta. We also detected potential transcription factors, including bZIP53, WRKY40 and GATA17, that are involved in compression stress while meta-data analysis enabled identification of several transcription factors that regulated by both compression and wounding in kiwifruit. The meta-analysis of all the transcriptional and metabolic data, for the two types of stress, and more specifically for the pericarp tissue, enabled identification of several commonly expressed genes and TFs that regulated by both compression and wounding in kiwifruit. Overall, the results of the present study provide a first characterization of the changes involved in kiwifruit mechanical stress and provide important insights into the molecular basis of this phenomenon.

Ο τραυματισμός των καρπών της ακτινιδιάς αποτελεί συχνό φαινόμενο κατά τη συγκομιδή και τη μετασυλλεκτική τους διαχείριση με αποτέλεσμα να επηρεάζεται άμεσα η διαδικασία της ωρίμανσής τους. Αυτό έχει ως συνέπεια να υποβαθμίζεται η ποιότητα των καρπών γεγονός που επιφέρει σημαντικές οικονομικές απώλειες. Η γνώση αναφορικά με το ρόλο των μηχανικών καταπονήσεων στο μεταβολισμό των ακτινιδίων και οι μηχανισμοί που τους διέπουν είναι περιορισμένη. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή διερευνήθηκε η μετασυλλεκτική επίδραση του τραυματισμού σε καρπούς ακτινιδιάς ποικιλίας ‘Hayward’ χρησιμοποιώντας αναλύσεις των φυσιολογικών χαρακτηριστικών και μοριακές τεχνικές υψηλής απόδοσης, όπως μεταβολομική και τρανσκριπτομική. Χρησιμοποιήθηκαν δυο πειραματικές προσεγγίσεις, ήτοι «τεχνητός τραυματισμός» και «δύναμη συμπίεσης» που αντικατοπτρίζουν δυο διαφορετικούς τύπους τραυματισμού/μηχανικής καταπόνησης. Κατά τον τεχνητό τραυματισμό, εισήχθη βελόνα σε βάθος ενός εκατοστού και μελετήθηκαν τα χαρακτηριστικά ωρίμανσης για την χρονική περίοδο των 8 ημερών ωρίμανσης των καρπών σε θερμοκρασία δωματίου (0oC). Παρατηρήθηκε επαγωγή της ωρίμανσης στους τραυματισμένους καρπούς που αποτυπώθηκε με μεταβολές στη συνεκτικότητα, την αναπνευστική δραστηριότητα και την παραγωγή του αιθυλενίου. Επιπλέον, η χρώση του ασβεστίου (Ca2+) με χρήση δείκτη φθορισμού Fluo-3 AM εντόπισε χωρικά το Ca2+ στην περιοχή του τεχνητού τραυματισμού μετά από 8 ημέρες ωρίμανσης. Επιπρόσθετα, η μεταβολομική ανάλυση έδειξε ότι πολλά σάκχαρα, συμπεριλαμβανομένης της φρουκτόζης, της γλυκόζης και της σακχαρόζης, καθώς και οργανικά οξέα όπως το κιτρικό, και το γαλακτουρονικό οξύ αυξήθηκαν κατά τον τραυματισμό. Μέσω της μαζικής ανάλυσης της γονιδιακής έκφρασης των τραυματισμένων ακτινιδίων διαπιστώθηκε η αυξημένη έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται στην αμυντική απόκριση, τη σύνδεση ιόντων ασβεστίου, τον κύκλο του κιτρικού οξέος, τα σάκχαρα, το δευτερογενή μεταβολισμό, τον μεταβολισμό των λιπιδίων, την αποικοδόμηση της πηκτίνης και τη βιοσύνθεση και διαμεταγώγηση του αιθυλενίου και της αυξίνης. Αντίθετα, γονίδια που σχετίζονται με τις υδατοπορίνες, παρουσίασαν μειωμένη έκφραση στους τραυματισμένους καρπούς. Κατά τη μηχανική συμπίεση, εφαρμόσθηκε δύναμη 15 kg, κατά τη συγκομιδή των καρπών καθώς και μετά από τη βραχεία (14 ημέρες) ή τη μακρά (3 μήνες) ψυχρή συντήρησή τους (0℃). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι και αυτός ο τύπος τραυματισμού προκάλεσε επαγωγή της ωρίμανσης. Επιπλέον, η σήμανση φθοριζόντων αντισωμάτων, που σχετίζονται με το κυτταρικό τοίχωμα, έδειξε ότι οι πρωτεΐνες αραβινογαλακτάνης και οι ξυλογλυκάνες μεταβλήθηκαν λόγω της συμπίεσης, ενώ η δράση της πηκτινομεθυλεστεράσης μειώθηκε μετά από μακρά ψυχρή συντήρηση. Επιπλέον, ενδοκυτταρικά σήματα ασβεστίου ανιχνεύθηκαν κοντά στις περιοχές συμπίεσης των ακτινιδίων αμέσως μετά τη μηχανική επεξεργασία. Αρκετοί πρωτογενείς μεταβολίτες παρουσίασαν μικρή διαφοροποίηση ενώ η τρανσκριπτομική ανάλυση ανέδειξε πολυάριθμα γονίδια, που εμπλέκονται σε βασικές λειτουργίες όπως στο μεταβολισμό των σακχάρων, τον κύκλο του κιτρικού οξέος, το κυτταρικό τοίχωμα, το αιθυλένιο και τις φυτο-ορμόνες, και επηρεάστηκαν από μηχανική καταπόνηση στο περικάρπιο και ιδιαίτερα στον πλακούντα. Επιπλέον, εντοπίσθηκαν πιθανοί μεταγραφικοί παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων των bZIP53, WRKY40 και GATA17, που εμπλέκονται στην καταπόνηση κατά τη συμπίεση. Η μέτα-ανάλυση του συνόλου των μεταγραφικών δεδομένων για τον ιστό του περικαρπίου, ανέδειξε την ύπαρξη πολλών κοινώς εκφραζόμενων γονιδίων και μεταγραφικών παραγόντων σε συνθήκες τραυματισμού/μηχανικής καταπόνησης. Συνολικά, τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής παρέχουν έναν πρώτο χαρακτηρισμό των μεταβολών που εμπλέκονται στον τραυματισμό των καρπών ακτινιδιάς και παρέχουν σημαντικές πληροφορίες για τη μοριακή βάση της μηχανικής καταπόνησης στους καρπούς ακτινιδιάς.