Έκφραση και ρόλος της aggrecan και perlecan στο πρώιμο έμβρυο

Abstract

The development of the embryo is determined by specific interactions between cells and components of the extracellular matrix. The extracellular matrix of the embryo is exuberantly rich in proteoglycans, the primary and earliest expressed ones being perlecan and aggrecan. Relatively little is known about the perlecan and aggrecan tissue specific distribution or function during early development in the vertebrae embryo. We studied the spatio-temporal distribution of perlecan and aggrecan by RT-PCR, immunofluore-scence and immunoprecipitation in the early chick embryo from the blastoderm at stage X (morula) to stage HH17 (29-32 somites). In addition, we studied the functional importance of perlecan and aggrecan in the early chick embryo by using blocking antibodies. Perlecan is a multi-faceted heparan sulfate proteoglycan for «many reasons and seasons» because of its ability to interact specifically with growth factors, other extracellular matrix components and cell surface molecules. Perlecan was first detectable at the morula stage just before the assembly of the first basement membrane. Perlecan fluorescence was intense in the cells ingressing through the primitive streak at stage HH3-4 (gastrula) in order to become part of the three germ layers. At stage HH10-11 (12 somites), perlecan was intense in the notochord and in the neuroepithelium of myelenchephalon, diecenphalon and neural tube but was essentially non-detectable in the neuroepithelium and the intensity had shifted to the basement membranes of these organs by stage HH17. The pre-migratory and migrating neural crest cells showed intense perlecan fluorescence. Perlecan immunoreactivity was intense in the mesonephric duct, intense within the thymus primordium and the lung rudiment. In the developing eye, the lens basement membrane in the vicinity of the adjacent ectoderm and between the pigment and sensory layers of retina was labelled intensely. Perlecan presence was strong in the developing heart, dorsal aorta and gut. The accumulating extracellular matrix displayed intense fluorescence for perlecan at all stages that being studied. The immunoprecipitation showed perlecan at Mr about 400kDa. We also studied the role of perlecan by using blocking antibodies during stages XI (morula) and HH3 (gastrula). Our results showed that perlecan is not required for the initial stages of mesoderm induction but seems to participate in the later processes of mesoderm commitment (cardiac cell proliferation, somitic cell proliferation, segmentation and epithelialization) and morphogenesis of organs like neural tube, heat and dorsal aorta. Perlecan interacts with growth factors and their receptors and participates in the signalling pathways that guide gastrulation movements and neural crest cell migration, proliferation and survival, and paraxial mesoderm (somitic) cell proliferation and segmentation.Aggrecan is a chondroitin sulphate/ keratan sulphate proteoglycan and forms enormous link-protein-stabilized aggregates with hyaluronan acid. Because it is inhibitory to the attachment of neurons and outgrowth of their axons and to neural crest cell migration in the culture, aggrecan has been characterized as the ‘repulsive’ hyaluronan-binding proteoglycan. Aggrecan was first detectable at the blastula stage (stage XIII) and its presence may be important for the formation of blastocoel, the first embryonic cavity at this stage. In embryos at stage HH3 (intermediate streak), migrating cells of the epiblast displayed intensely labeled pericellular coats. Aggrecan fluorescence was intense in the neural plate and the accumulating extracellular matrix in embryos at stage HH4 (late gastrula). In embryos at stage HH13 (19 somites), aggrecan fluorescence was intense in the neural tube, notochord but was reduced in the neuroepithelium and labeling was intense toward the lumen of the brain, neural tube and the periphery of notochord by stage HH17. The dermatomyotome of somites but not the sclerotome of somites displayed labelling in embryos at stages HH13 και HH17. In the developing heart, aggrecan fluorescence was intense and may participate in the morphogenesis of the heart. Aggrecan presence was intense in the migrating neural crest cells, strong in the wall of the dorsal aorta and at the border of the gut lumen. When tested in functional studies in embryos at the onset of gastrulation, stages HH1 (just before the morphogenetic movements of gastrulation) and HH3 (intermediate streak). Lack of functional aggrecan interfered with tissue architecture during normal morphogenesis of the brain, notochord, heart tube, dorsal aorta and gut. Both perlecan and aggrecan have unique properties and functions during the development of the embryo. The role of perlecan seems to be important for the formation of basement membrane, epithelialization of tissues and availability of growth factors. The role of aggrecan in concert with link protein and hyaluronic acid is fundamental for the formation and maintenance of embryonic cavities and for determination of passages during migration of cells and organogenesis.

Η ανάπτυξη του εμβρύου καθορίζεται από τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ κυττάρων και εξωκυττάριας ύλης. Στην εξωκυττάρια ύλη περιέχονται πρωτεογλυκάνες, εκ των οποίων οι perlecan και aggrecan είναι από τις πρώτες που εκφράζονται στο πρώιμο έμβρυο. Λίγα είναι γνωστά για την έκφραση και τον ρόλο τους κατά την ανάπτυξη του πρώιμου εμβρύου των σπονδυλωτών. Μελετήσαμε τη χωρο-χρονική κατανομή των perlecan και aggrecan με RT-PCR, ανοσοφθορισμό και ανοσοκατακρήμνιση από το στάδιο Χ (μορίδιο) έως το στάδιο ΗΗ17 (29-32 σωμίτες) στο πρώιμο έμβρυο όρνιθας. Επιπρόσθετα, μελετήσαμε το ρόλο των perlecan και aggrecan με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι αυτών κατά την ανάπτυξη του πρώιμου εμβρύου.Η perlecan είναι μια πολυδιάστατη πρωτεογλυκάνη θειϊκής ηπαράνης η οποία αληλεπιδρά με αυξητικούς παράγοντες, άλλα μόρια της εξωκυττάριας ύλης και με μόρια της κυτταρικής επιφάνειας. Η perlecan πρωτο-ανιχνεύτηκε στο στάδιο του μοριδίου (στάδιο Χ) μόλις πριν τη συναρμολόγηση της πρώτης βασικής μεμβράνης που σχηματίζεται στο πρώιμο έμβρυο. Ο φθορισμός για την perlecan ήταν έντονος στα κύτταρα της επιβλάστης που μεταναστεύουν μέσα από την πρωτογενή αύλακα στο στάδιο ανάπτυξης ΗΗ3-4 (γαστρίδιο) για να αποικήσουν τις τρεις βλαστικές στοιβάδες. Στο στάδιο ΗΗ10-11 (12 σωμίτες) η perlecan ανιχνεύεται με υψηλή ένταση στα νευροεπιθηλιακά κύτταρα των μυελεγκεφάλου, διεγκεφάλου, νευρικού σωλήνα και της νωτοχορδής όμως τα επίπεδα της είχαν μειωθεί αισθητά στο νευροεπιθήλιο και υψηλή ένταση φθορισμού ανιχνεύτηκε στις βασικές μεμβράνες των οργάνων αυτών στο στάδιο ΗΗ17 (29 σωμίτες). Τα κύτταρα των νευρικών κρηπίδων πριν αλλά και κατά τη διάρκεια της μετανάστευσης εκφράζουν έντονα perlecan. Ο φθορισμός για την perlecan ήταν έντονος στο μεσονεφρό, στο θύμο αδένα και στις καταβολές του πνεύμονα στο στάδιο ΗΗ17. Στον οφθαλμό, μεγάλη ήταν η ένταση φθορισμού για την perlecan στο φακό και ειδικότερα στη βασική μεμβράνη που είναι σε γειτνίαση με το παρακείμενο του εξώδερμα (μελλοντικός κερατοειδής χιτώνας/prospective cornea) και στον αμφιβληστροειδή χιτώνα, μεταξύ της χρωματοφoρούχου και αισθητήριας στοιβάδας του αμφιβληστροειδή χιτώνα. Η παρουσία της perlecan ήταν έντονη σε όλη την έκταση της αναπτυσόμενης καρδιάς. Η συναθροισμένη εξωκυττάρια ύλη επέδειξε εξαιρετικά έντονο φθορισμό για την perlecan σε όλα τα στάδια ανάπτυξης που μελετήθηκαν Το ειδικό αντίσωμα έναντι της αυτής κατακρήμνισε νέο-συντιθέμενη πρωτεΐνη με μοριακή μάζα περίπου στα 400 kDa. Για τη μελέτη του ρόλου της perlecan χρησιμοποιήσαμε μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της perlecan σε έμβρυα στα στάδια ανάπτυξης ΧΙ (μορίδιο) και ΗΗ3 (γαστρίδιο). Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι η perlecan δεν απαιτείται για τα αρχικά στάδια επαγωγής του μεσοδέρματος αλλά φαίνεται να είναι σημαντική στην μετέπειτα αναπτυξιακή του πορεία (πολλαπλασιασμός καρδιακών κυττάρων, πολλαπλασιασμός κυττάρων των σωμιτών, κατάτμηση και επιθηλιοποίηση του παρα-αξονικού μεσοδέρματος) και επίσης στη μορφογένεση οργάνων όπως ο νευρικός σωλήνας, η καρδιά και η ραχιαία αορτή. Η perlecan που αλληλεπιδρά με αυξητικούς παράγοντες και τους υποδοχείς τους συμμετέχει στα μονοπάτια μεταγωγής σήματος που ρυθμίζουν τις μορφογενετικές κινήσεις της γαστριδίωσης, της μετανάστευσης των κυττάρων των νευρικών κρηπίδων, τον πολλαπλασιασμό και επιβίωση των κυττάρων και τη κατάτμηση του παρα-αξονικού μεσοδέρματος (σωμίτες). Η aggrecan φέρει αλυσίδες θειϊκής χονδροιτίνης και θειϊκής κεράτανης και σχηματίζει μεγαλομοριακά συμπλέγματα με το υαλουρονικό οξύ μέσω της συνδετικής πρωτεΐνης. Αναστέλει δραστικά την προσκόλληση των νευρώνων και την προέκταση των αξόνων τους αλλά και τη μετανάστευση των κυττάρων των νευρικών κρηπίδων και για αυτό έχει χαρακτηριστεί ως απωθητική/ αντιπροσκολλητική πρωτεογλυκάνη. Ανιχνεύσαμε την aggrecan για πρώτη φορά στο στάδιο του βλαστιδίου (στάδιο ΧΙΙΙ) και η παρουσία της φαίνεται να είναι καθοριστικής σημασίας στη δημιουργία του βλαστόκοιλου, της πρώτης εμβρυϊκής κοιλότητας, στο στάδιο αυτό. Σε έμβρυα στο στάδιο ΗΗ3 (ενδιάμεσο γαστρίδιο) κύτταρα της επιβλάστης που μεταναστεύουν μέσα από την πρωτογενή αύλακα έδειξαν έντονη σήμανση για την aggrecan. Στο στάδιο ΗΗ4 (προχωρημένο γαστρίδιο) ο φθορισμός για την aggrecan παρουσιάζει ένταση στη νευρική πλάκα και στην συναθροισμένη εξωκυττάρια ύλη μέσα στις κοιλότητες εκατέρωθεν της νευρικής πλάκας. Στα έμβρυα στο στάδιο ΗΗ13 (19 σωμίτες), η aggrecan ανιχνεύτηκε σε υψηλά επίπεδα σε όλο το νευροεπιθήλιο του νευρικού σωλήνα και της νωτοχορδής όμως μέχρι το στάδιο ΗΗ17 (29 σωμίτες) η aggrecan είχε μειωθεί στο νευροεπιθήλιο και έδειχνε ένταση φθορισμού στο περίγραμμα των εσωτερικών τοιχωμάτων του τελεγκεφάλου και του νευρικού σωλήνα και στην περιφέρεια της νωτοχορδής. Ένταση φθορισμού για την aggrecan ανιχνεύτηκε στο δερμομυοτόμo αλλά όχι στο σκληροτόμο στο σωμίτη στα στάδια ανάπτυξης ΗΗ13 και ΗΗ17. Η ένταση φθορισμού για την aggrecan στο μυοκάρδιο, ενδοκάρδιο και στην εξωκυττάρια ύλη της αναπτυσσόμενης καρδιάς στο στάδιο ΗΗ17 φανερώνει ότι η aggrecan μπορεί να συμμετέχει στην μορφογένεση της καρδιάς. Επιπρόσθετα στο στάδιο ΗΗ17, πολύ έντονο φθορισμό φανέρωσαν τα κύτταρα των νευρικών κρηπίδων που μεταναστεύουν και τα τοιχώματα της ραχιαίας αορτής και του εντέρου. Για τη μελέτη του ρόλου της aggrecan χρησιμοποιήσαμε μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι αυτής σε έμβρυα που βρίσκονταν στα στάδια της γαστριδίωσης ΗΗ1 (μόλις πριν την έναρξη των μορφογενετικών κινήσεων της γαστριδίωσης) και ΗΗ3 (ενδιάμεσο γαστρίδιο). Η αναστολή της δράσης της aggrecan προκάλεσε ανωμαλίες στην αρχιτεκτονική των ιστών και τη φυσιολογική μορφογένεση του εγκεφάλου, της καρδιάς, της ραχιαίας αορτής, της νωτοχορδής και των σωμιτών. Οι perlecan και aggrecan έχουν μοναδικές ιδιότητες και λειτουργίες κατά την ανάπτυξη του πρώιμου εμβρύου. Ο ρόλος της perlecan φαίνεται να είναι σημαντικός στη δόμηση βασικών μεμβρανών, στην επιθηλιοποίηση ιστών και στη διαθεσιμότητα αυξητικών παραγόντων. Ο ρόλος της aggrecan σε συνεργισμό με την συνδετική πρωτεΐνη και το υαλουρονικό οξύ φαίνεται να είναι σημαντικός στη δημιουργία και τη διατήρηση της αρχιτεκτονικής των εμβρυϊκών κοιλοτήτων και στη δημιουργία διόδων για την μετανάστευση κυττάρων και την οργανογένεση.