Έκφραση και ρόλος των πρωτεογλυκανών CD44 και versican κατά την ανάπτυξη του πρώιμου εμβρύου

Abstract

Proteoglycans and their associated glycosaminoglycans can bind growthfactors, integrin and non-integrin cell surface molecules, enzymes, proteaseinhibitors and other extracellular matrix components including fibronectin,laminin and tenascin. We studied the expression and spatiotemporaldistribution of versican and CD44 by RT-PCR and immunofluorescence inthe chick embryo from the morula stage (stage XI-XII) to early organogenesis(stage HH16+, 28-29 somites). We also studied the versican and CD44 roleby using blocking antibodies in the early chick embryo.Versican is a chondroitin sulfate proteoglycan that binds growth factorsand interacts with various extracellular matrix proteins and cell surfacemolecules including the CD44. Combined RT-PCR and immunohistochemistrydemonstrated the expression of versican as early as the morula stage.Interestingly, we detected splice variants of versican at the morula stage, andtheir expression was developmentally regulated. The presence of versicanmRNA at the morula stage may indicate that it is of oogenetic origin. Versicanfluorescence was strong in the epiblast and the hypoblast at the late blastulastage (XIII). At stage HH3+ (intermediate streak), versican expression wasintense in the cells ingressing through the primitive streak and the migratingmesenchymal cells which will form the mesoderm and endoderm. By thedefinitive streak stage (HH4), versican fluorescence was intense in the cellsingressing through the primitive streak and in the mesenchymal cells thathave already started to form the mesoderm and endoderm. At stage HH8 (4somite pairs), versican expression was strong in the neural plate, theelevated neural folds and the ectoderm neighboring the neural folds. At stageHH12 (16 somite pairs), versican fluorescence was intense in the neural tubeand its adjacent ectoderm, the neural crest cells, the somite and in themesonephros and in the adjacent lateral mesoderm that will form themesonephric tubules. Later in development, versican fluorescence wasintense in the diencephalon, the optic stalk, mesencephalon, myelencephalon.Versican fluorescence was also intense in the dorsal mesocardium,myocardium and endocardium, dorsal aorta and aortic arches, in themyotome and sclerotome in somites, gut and in the extracellular matrix ofembryonic cavities. Inhibition of the function of versican by blockingantibodies showed that versican is crucial for the neural tube closure, neuralcrest migration, formation of the heart tube, for the architecture of embryoniccavities and consequently tissue and organ morphogenesis.CD44 is a transmembrane part-time proteoglycan and the main receptorfor hyaluronan. We detected CD44 protein even at the morula stage. Thepresence of high levels of CD44 mRNA at the morula stage indicated that thisis an oogenetic mRNA. CD44 fluorescence was strong in the epiblast cells,especially those neighboring the blastocoele, and in the hypoblast at the lateblastula stage (XIII). At stage HH3+, during gastrulation, CD44 was expressedstrongly in the epiblast cells, in mesenchymal cells and in endoderm cells. Atstage HH8 (4 somite pairs), strong CD44 expression was detected in theneural plate and neural folds and their adjacent ectoderm and this expressionpattern was similar to that of versican. Later in development, CD44expression was intense in the diencephalon, optic stalks, mesencephalon,myelencephalon, metencephalon, auditory vesicles and the neural crest cellsmigrating towards the auditory vesicle and the neural tube. CD44fluorescence was also intense in the dorsal mesocardium, myocardium,endocardium, aortae and aortic arches, sclerotome and myotome in somites,mesonephros, liver, gut and in the migrating neural crest cells that will formthe sympathetic and enteric ganglia. Inhibition of CD44 function by blockingantibodies showed that CD44 is crucial for the architecture of the embryoniccavities such as the brain lumen, neural tube closure, neural crest cellmigration, cardiac and cardiovascular formation and somite morphogenesis.Our results showed a synergistic role of CD44 and versican during thedevelopment of the early embryo.

Οι πρωτεογλυκάνες και οι αλυσίδες γλυκοζαμινογλυκανών τους αλληλε-πιδρούν με αυξητικούς παράγοντες, διαμεμβρανικούς υποδοχείς όπως οιιντεγκρίνες, ένζυμα, αναστολείς πρωτεασών και με άλλα μόρια τηςεξωκυττάριας ύλης όπως η ινονεκτίνη, η λαμινίνη και η tenascin. Στηνπαρούσα διατριβή μελετήσαμε τη χωροχρονική κατανομή των πρωτεο-γλυκανών versican και CD44 με τη μέθοδο της RT-PCR και τουανοσοφθορισμού από το στάδιο ΧΙ-ΧΙΙ (μορίδιο) έως το στάδιο ΗΗ16+ (28-29ζεύγη σωμιτών) και τον ρόλο της versican και της CD44 με τη χρήσημονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι αυτών κατά την ανάπτυξη του πρώιμουεμβρύου.Η versican είναι πρωτεογλυκάνη θειικής χονδροϊτίνης και αλληλεπιδράμε αυξητικούς παράγοντες, με διάφορες πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ύλης καιμε διαμεμβρανικούς υποδοχείς όπως η CD44. Τα αποτελέσματα της RT-PCRέδειξαν ότι το mRNA της versican εκφράζεται σε όλα τα αναπτυξιακά στάδιαπου μελετήσαμε. Ενδιαφέρον παρουσιάζουν τα προϊόντα εναλλακτικήςωρίμανσης της versican που ανιχνεύσαμε ακόμα και στο στάδιο του μοριδίουκαι που η έκφρασή τους ρυθμίζεται αναπτυξιακά. Η παρουσία του mRNA τηςversican σε υψηλά επίπεδα στο στάδιο του μοριδίου (ΧΙ-ΧΙΙ) υποδεικνύει ότιτο mRNA της versican είναι ωογενετικής προέλευσης στο στάδιο αυτό. Ταπειράματα μας του ανοσοφθορισμού έδειξαν ότι η versican πρωτεΐνηανιχνεύεται στο στάδιο του μοριδίου και εκφράζεται έντονα στην επιβλάστη καιστην υποβλάστη στο στάδιο του προχωρημένου βλαστιδίου (στάδιο ΧΙΙΙ). Στοστάδιο ΗΗ3+ (ενδιάμεσο γαστρίδιο / intermediate streak) παρατηρήσαμεμεγάλη ένταση φθορισμού στα κύτταρα που μεταναστεύουν μέσα από τηνπρωτογενή αύλακα και στα μεσεγχυματικά κύτταρα που θα σχηματίσουν τομεσόδερμα και το ενδόδερμα. Στο στάδιο ΗΗ4 (προχωρημένο γαστρίδιο /definitive streak) ένταση φθορισμού της versican ανιχνεύθηκε κύτταρα πουμεταναστεύουν μέσα από την πρωτογενή αύλακα καθώς και στα κύτταρα πουέχουν αρχίσει να σχηματίζουν το μεσόδερμα και το ενδόδερμα. Στο στάδιοπου το έμβρυο έχει σχηματίσει 4 ζεύγη σωμιτών (στάδιο ΗΗ8), ανιχνεύσαμε υψηλή ένταση φθορισμού της versican στη νευρική πλάκα και στις νευρικέςπτυχές καθώς ανασηκώνονται να σχηματίσουν το νευρικό σωλήνα. Στοστάδιο ΗΗ12 (16 ζεύγη σωμιτών), ισχυρή ένταση φθορισμού της versicanανιχνεύσαμε στο νευρικό σωλήνα, στο γειτονικό του εξώδερμα, στα κύτταρατης νευρικής ακρολοφίας (neural crest), στα κύτταρα του σωμίτη, στομεσονέφρο και στο γειτονικό του πλάγιο μεσόδερμα που θα σχηματίσει τουςμεσονεφρικούς σωληνίσκους. Αργότερα στην ανάπτυξη, ισχυρή έντασηφθορισμού της versican ανιχνεύσαμε επίσης στο διεγκέφαλο, στον οπτικόμίσχο, στο μεσεγκέφαλο, στο μυελεγκέφαλο, στα τοιχώματα του φάρυγγα καιτης ραχιαίας αορτής, στο ραχιαίο μεσοκάρδιο, στο μυοκάρδιο και στοενδοκάρδιο, στο μυοτόμο και σκληροτόμο στους σωμίτες, στα τοιχώματα τουεντέρου, καθώς και στην εξωκυττάρια ύλη των εμβρυϊκών κοιλοτήτων.Πειράματα σε έμβρυα που εκτέθηκαν στο αντίσωμα έναντι της versican σεδιαφορετικά στάδια ανάπτυξης από το μορίδιο ως το προχωρημένο γαστρίδιοέδειξαν ότι η versican πιθανόν να συμμετέχει στα μονοπάτια σηματοδότησηςπου καθοδηγούν τη μετανάστευση των κυττάρων της νευρικής ακρολοφίας,στο μοριακό δίκτυο για το σχηματισμό του νευρικού σωλήνα, στον καθορισμόή / και στη διαμερισματοποίηση των προκαρδιακών κυττάρων κατά τοσχηματισμό της καρδιάς και στη διατήρηση της αρχιτεκτονικής των εμβρυϊκώνκοιλοτήτων.Η CD44 είναι πρωτεογλυκάνη της κυτταρικής επιφάνειας και είναι οκύριος υποδοχέας του υαλουρονικού. Ανιχνεύσαμε τη CD44 πρωτεΐνη ακόμακαι στο στάδιο του μοριδίου. Η παρουσία του mRNA της CD44 σε υψηλάεπίπεδα στο στάδιο του μοριδίου μπορεί να δείχνει ότι το mRNA είναιωογενετικής προέλευσης. Με τη μέθοδο του ανοσοφθορισμού ανιχνεύσαμεέντονο φθορισμό της CD44 στα κύτταρα της επιβλάστης και ειδικότερα σεαυτά που γειτονεύουν με το βλαστόκοιλο και στην υποβλάστη στο στάδιο τουπροχωρημένου βλαστίδιου (ΧΙΙΙ), ενώ στο στάδιο ΗΗ3+ καθώς συνεχίζονται οιμορφογενετικές κινήσεις της γαστριδίωσης, η CD44 παρουσιάζει ισχυρήένταση φθορισμού στα κύτταρα της επιβλάστης ,στα μεσεγχυματικά κύτταρακαι στα κύτταρα του ενδοδέρματος. Στο στάδιο ΗΗ8 (4 ζεύγη σωμίτες),ανιχνεύσαμε ένταση φθορισμού της CD44 στη νευρική πλάκα και στις νευρικές πτυχές με πρότυπο έκφρασης παρόμοιο με αυτό της έκφρασης τηςversican. Αργότερα στην ανάπτυξη, στο στάδιο ΗΗ16+ (28-29 ζεύγησωμιτών) ανιχνεύσαμε ισχυρή ένταση φθορισμού της CD44 ανιχνεύθηκε στατοιχώματα του διεγκεφάλου, του μεσεγκεφάλου και του νευρικού σωλήνα, στατοιχώματα του φάρυγγα, στις ραχιαίες και κοιλιακές αορτές, στα αορτικά τόξα,στη νωτοχορδή, στην εξωκυττάρια ύλη στην κοιλότητα του μεσεγκεφάλου καιστην κοιλότητα του φάρυγγα, στο ακουστικό κυστίδιο και στην κοιλότητα τουακουστικού κυστιδίου και στα κύτταρα της νευρικής ακρολοφίας πουμεταναστεύουν προς το ακουστικό κυστίδιο. Υψηλή ένταση φθορισμού τηςCD44 ανιχνεύσαμε επίσης στο σκληροτόμο και στο μυοτόμο στους σωμίτες,στα κύτταρα της νευρικής ακρολοφίας, στο ήπαρ, στο μυοκάρδιο, στοενδοκάρδιο, στον αγωγό φλέβας και στο μεσονέφρο. Έμβρυα που εκτέθηκανστο αντίσωμα έναντι της CD44 σε διαφορετικά στάδια ανάπτυξης από τομορίδιο ως το πρώιμο νευρίδιο έδειξαν το σημαντικό ρόλο της CD44 στηνμορφογένεση του εγκεφάλου, στη διατήρηση της αρχιτεκτονικής τηςκοιλότητας του εγκεφάλου και των άλλων εμβρυϊκών κοιλοτήτων, στηνμετανάστευση των κυττάρων της νευρικής ακρολοφίας, στον σχηματισμό τηςκαρδιάς και του αγγειακού συστήματος και στη μορφογένεση των σωμιτών.Τα αποτελέσματα μας έδειξαν τη συνεργιστική δράση των CD44 και versicanκατά την ανάπτυξη του πρώιμου εμβρύου.