Αποτοξικοποίηση χλωροφαινολών από το θαλάσσιο μικροφύκος Tetraselmis marina

Abstract

Τhe metabolic and physiological responses of the marine microalga Tetraselmis marina to p-chlorophenol (p-CP) were studied. The main limiting factor in the study of p-CP metabolism in T. marina was the low production of microalgal biomass. In closed flasks with NaHCO3 as inorganic carbon source biomass production did not exceed 0.25 g L-1. In order to increase biomass production, growth of T. marina was studied in (a) 2 L cylindrical photobioreactor (12.4 cm inner diameter) and (b) 0.25 L glass column photobioreactors (2.6 cm inner diameter). CO2 enriched compressed air (1% v/v) was used in both systems as inorganic carbon source. There was a 22-fold improvement in biomass production which reached 5.4 g L-1. p-CP was toxic to T. marina negatively affecting both the growth rate and the final biomass production. The inhibition constant EC50 for p-CP was found to be 250 μM. p-CP also affected the physiology of T. marina causing cell aggregation and loss of flagellates. T. marina efficiently removed p-CP from the growth medium. During growth of T. marina in the presence of p-CP, two metabolites were formed and accumulated in the growth medium. The two metabolites were more polar than p-CP, and their appearances were concomitant with the disappearance of p-CP. The two metabolites were isolated and identified as p-chlorophenyl-β-D-glucopyranoside (p-CPG) and p-chlorophenyl-β-D-(6-O-malonyl)-glucopyranoside (p-CPGM). The molecular structures of p-CPG and p-CPGM were further confirmed by enzymatic and alkaline hydrolyses. In this study, we demonstrated that O-glucosylation with subsequent 6-O-malonylation of the glucoconjugate was the route of p-CP metabolism in T. marina. The combination of glucosyl transfer and malonyl transfer has previously been reported in plants in the presence of a number of xenobiotics. Here, we present the first evidence that this metabolic pathway is also present in microalgae. T. marina also metabolizes 2,4-dichlorophenol (2,4-DCP) utilizing the same pathway. The comparative study of metabolic responses of the microalga to all dichlorophenol congeners showed that T. marina glucosidates all dichlorophenols except 2,6- και 3,5-DCP. The metabolism of p-CP in T. marina was mainly driven by photosynthesis, and to a lesser extent by anabolic metabolism in the dark. Finally p-CP did not induce mRNA expression of the oxidative stress indicator enzyme ascorbate peroxidase.

Μελετήθηκε η επίδραση της π-χλωροφαινόλης (p-CP) στην ανάπτυξη και φυσιολογία του θαλάσσιου μικροφύκους Tetraselmis marina καθώς και η μεταβολική του απόκριση σε αυτή. Βασικός περιοριστικός παράγοντας στη μελέτη του μεταβολισμού της p-CP στο T. marina ήταν η χαμηλή παραγωγή βιομάζας του μικροφύκους. Σε κλειστές φιάλες, με NaHCO3 ως πηγή ανόργανου άνθρακα η βιομάζα δεν ξεπέρασε τα 0.25 g L-1. Για το λόγο αυτό μελετήθηκε η ανάπτυξη του μικροφύκους και σε κυλινδρικό φωτοβιοαντιδραστήρα 2 L διαμέτρου 12.4 cm αλλά και σε φωτοβιοαντιδραστήρες-στήλες 0.25 L διαμέτρου 2.6 cm. Ως πηγή άνθρακα στα συστήματα αυτά χρησιμοποιήθηκε μίγμα 1% CO2 σε αέρα ενώ η παραγωγή βιομάζας βελτιώθηκε κατά 22 φορές φτάνοντας τα 5.4 g L-1. Η p-CP έχει τοξική δράση στο T. marina επηρεάζοντας το ρυθμό ανάπτυξής του και την παραγωγή βιομάζας. H τιμή ΕC50 για την p-CP βρέθηκε ίση με 250 μM ενώ παρουσία υψηλότερων συγκεντρώσεων p-CP παρατηρήθηκε ότι τα κύτταρα του T. marina απορρίπτουν τα μαστίγιά τους, παύουν να κινούνται και εμφανίζουν έντονη συσσωμάτωση. Το T. marina διαθέτει την ικανότητα να την απομακρύνει την p-CP από το μέσο καλλιέργειας. Η απομάκρυνση της χλωροφαινόλης από το μικροφύκος συνοδεύτηκε από την συσσώρευση στο μέσο καλλιέργειας δύο μεταβολιτών περισσότερο υδρόφιλων από την π-χλωροφαινόλη, οι οποίοι απομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν ως π-χλωροφαινυλ-β-D-γλυκο-πυρανοζίτης (p-CPG) και π-χλωροφαινυλ-β-D-(6-O-μαλονυλ)-γλυκοπυρανοζίτης (p-CPGM). Η δομή των δύο μεταβολιτών επιβεβαιώθηκε με ενζυμική και αλκαλική υδρόλυσή τους. Επομένως, ο μεταβολισμός της p-CP στο T.marina πραγματοποιείται μέσω της Ο-γλυκοζυλίωσης και της διαδοχικής 6-O-μαλονυλίωσης του γλυκοσυζυγούς. Ο συνδυασμός αυτός μεταφοράς γλυκόζης και μαλονικού έχει αναφερθεί για ανώτερα φυτά και για αρκετές ξενοβιοτικές ουσίες. Εδώ, παρουσιάζεται η πρώτη απόδειξη ότι το μεταβολικό αυτό μονοπάτι χρησιμοποιείται και από μικροφύκη. Το ίδιο μεταβολικό μονοπάτι ακολουθείται και κατά την αποτοξικοποίηση της 2,4-διχλωροφαινόλης από το T. marina ενώ η συγκριτική μελέτη της μεταβολικής απόκρισης του T. marina σε όλες τις διχλωροφαινόλες έδειξε ότι το T. marina γλυκοζυλιώνει όλες τις διχλωροφαινόλες εκτός από τις 2,6- και 3,5-DCP. Η αποτοξικοποίηση χλωροφαινολών από το T. marina εξαρτάται κυρίως από τη φωτοσύνθεση και σε μικρότερο βαθμό από τον αναβολισμό του μικροφύκους στο σκοτάδι. Τέλος, η p-CP δεν βρέθηκε να προκαλεί επαγωγή της μεταγραφής της υπεροξειδάσης του ασκορβικού του T. marina, ενζύμου της αντιοξειδωτικής κυτταρικής άμυνας.