Διεργασίες σχηματοποίησης και χημικής τροποποίησης υποστρωμάτων για τη δημιουργία βιοψηφίδων για εφαρμογές στη βιο-νανοτεχνολογία

Abstract

The target of this thesis is the development of an innovative fabrication method for protein arrays on silicon or glass substrates. This method is based on micro-nano lithographic techniques in combination with chemical or/and topographic modification of selected regions of the chip. The proposed method significantly improves industrially available microarray fabrication methods. It aims at imprinting protein spots with minimum diameter of the order of 100 nm, i.e. at the fabrication of microarrays with spot density at least 105 times higher than currently possible with industrial methods. This can be achieved by preparing substrates, patterned, chemically and topographically modified, where thousands of protein spots can be printed by means of the industrial methods of robotic contact printing or ink-jet printing. In order to create two-dimensional topographies of the order of 100 nm in thin films we used colloidal lithography. The selectively created functional groups (of chemical affinity with biological molecules) are achieved through selective plasma chemical modification. The latter, was performed via selective etching or deposition of thin films in order to avoid protein adsorption in certain areas, while making possible the protein immobilization in desired areas. In these properly modified substrates, the creation of protein microarrays was demonstrated via selective protein immobilization using standard binding reactions. First, protein microarrays were created on patterned substrates of SiO2 spots on Si. After selective modification in C4F8 plasma and immersion in protein solution, proteins were immobilized selectively on SiO2 spots. This system of substrates displayed excellent selectivity, spot homogeneity and density. Furthermore, 200-300nm SiO2 nanospots were created on Si substrate via colloidal lithography and the thickness of the selectively immobilized protein film on SiO2 spots was estimated.In order to achieve protein microarrays on glass slides, a different approach was followed: the target protein immobilization area was the organic area of a resin. According to this approach, three different photosensitive polymeric materials were used, patterned on glass slides and different plasma chemistry plasma was used for the selective modification step. Excellent spot signal, selectivity, and spot uniformity were obtained on such substrates. Finally, polymer/glass substrates were further investigated in bioanalytical applications, in addition to model binding assays. Four mutations of BRCA1 gene were implemented: G1738R, 5382inscA and 3099delT. Our developed substrates were investigated in terms of wild to mutant discrimination ratios of the applied sequences and were compared with commercial substrates: PS and epoxy-silanized slides. Our patterned/modified substrates exhibited excellent stability, spot signal, selectivity and discrimination ratios for all the mutation sequences investigated, in comparison with commercial reference slides (PS and epoxy-silanized slides).

Η παρούσα διατριβή εστιάζει στην ανάπτυξη καινοτόμου μεθοδολογίας κατασκευής συστοιχιών πρωτεϊνών (protein arrays) πάνω σε ψηφίδες πυριτίου ή γυαλιού. Η μέθοδος βασίζεται σε μικρο/νανο-λιθογραφικές διαδικασίες σε συνδυασμό με χημική ή/και τοπογραφική τροποποίηση επιλεγμένων περιοχών της ψηφίδας. Η προτεινόμενη μέθοδος βελτιώνει σημαντικά τη βιομηχανική μέθοδο κατασκευής πρωτεϊνικών συστοιχιών μέσω ρομποτικών συστημάτων απόθεσης ( επαφής ή εκτόξευσης νανοσταγονιδίων). Επιτυγχάνει την αποτύπωση πρωτεϊνικών κηλίδων με ελάχιστη διάμετρο 100nm, δηλαδή την κατασκευή μικρο-συστοιχιών πυκνότητας τουλάχιστον 105 φορές μεγαλύτερη από αυτήν που επιτρέπουν σύγχρονες βιομηχανικές μέθοδοι απόθεσης πρωτεϊνών. Αυτό επιτυγχάνεται με την προετοιμασία σχηματοποιημένων και τροποποιημένων χημικά και τοπογραφικά υποστρωμάτων, πάνω στα οποία με την ανωτέρω μέθοδο μπορούν να τυπωθούν, σε ένα στάδιο, πολυάριθμες πρωτεϊνικές κηλίδες. Σαν τεχνική σχηματοποίησης λεπτών υμενίων με λιθογραφία υψηλής διακριτικής ικανότητας (κατά προτίμηση χαμηλού κόστους) χρησιμοποιήθηκε η λιθογραφία κολλοειδών σωματιδίων για να διαμορφώσει υποστρώματα με δισδιάστατες τοπογραφίες μικρών διαστάσεων (της τάξης των 100 nm). Η χημική τροποποίηση έγινε με επιλεκτική εγχάραξη/απόθεση (με πλάσμα) υμενίων σε επιφάνειες κατάλληλης χημικής σύστασης ώστε να αποφευχθεί η προσρόφηση πρωτεϊνών και ταυτόχρονα να εισάγονται στις τρισδιάστατες τοπογραφίες, χημικά συγγενείς με βιολογικά μόρια λειτουργικές ομάδες, ώστε να καθοριστούν οι περιοχές επικόλλησης των πρωτεϊνών. Η επιλεκτική προσρόφηση πρωτεϊνών πραγματοποιήθηκε με χρήση πρότυπων δεσμευτικών αντιδράσεων και ανίχνευση με χρήση ειδικών δεσμευτικών μορίων επισημασμένων με φθορίζοντα μόρια. Επίσης, μελετήθηκε η επίδραση της τραχύτητας των κηλίδων στο ποσό της προσροφημένης πρωτεΐνης και κατ’ ακολουθία στο λόγο σήματος/θορύβου της κατασκευαζόμενης πρωτεϊνικής συστοιχίας.Αρχικά, αναπτύχθηκαν πρωτεϊνικές συστοιχίες σε πρότυπα υποστρώματα σχηματοποιημένων κηλίδων SiO2 σε επιφάνεια Si. Μετά την επιλεκτική τροποποίηση με πλάσμα C4F8 και την εναπόθεση πρωτεϊνικού διαλύματος στο σύστημα υποστρωμάτων, οι πρωτεΐνες ακινητοποιούνται επιλεκτικά στις περιοχές του SiO2. Το συγκεκριμένο σύστημα παρουσίασε εξαιρετική συμπεριφορά ως προς την εκλεκτικότητα, την ομοιομορφία κηλίδων και την πυκνότητα των μικροσυστοιχιών. Περαιτέρω, για το συγκεκριμένο σύστημα με χρήση λιθογραφίας κολλοειδών κατασκευάστηκαν νανοκηλίδες SiO2 διάστασης 250-300nm και πραγματοποιήθηκε ποσοτικός προσδιορισμός του στρώματος πρωτεΐνης που ακινητοποιείται επιλεκτικά στις νανοκηλίδες SiO2. Προκειμένου να επιτευχθεί η δημιουργία πρωτεϊνικών μικροσυστοιχιών σε υποστρώματα γυαλιού η ακινητοποίηση της πρωτεΐνης εστιάστηκε στην οργανική περιοχή. Μελετήθηκαν τρία φωτοπολυμερικά υλικά, λιθογραφημένα σε υάλινη αντικειμενοφόρα πλάκα μικροσκοπίου. Έγινε αλλαγή της χημείας του πλάσματος η οποία απέδωσε ικανοποιητικά και στα τρία συστήματα πολυμερές/γυαλί (εξαιρετικό σήμα, εκλεκτικότητα και ομοιομορφία κηλίδας). Τέλος, στα υποστρώματα πολυμερές/γυαλί πραγματοποιήθηκε βιοαναλυτική εφαρμογή πέρα από την εφαρμογή των πρότυπων πρωτεϊνικών διαλυμάτων. Χρησιμοποιήθηκαν οι μεταλλάξεις G1738R, 5382insC,3741insA και 3099delT στο γονίδιο BRCA1. Τα υποστρώματα μελετήθηκαν ως προς της διάκριση υγιούς (άγριου) και μεταλλαγμένου τύπου των αλληλουχιών και συγκρίθηκαν με εμπορικά πλακίδια (πολυστυρενίου και επόξυ-σιλάνιο). Παρουσίασαν εξαιρετική σταθερότητα, σήμα, και υψηλούς λόγους διαχωρισμού και διάκρισης σήματος φθορισμού για όλες τις αλληλουχίες των μεταλλάξεων σε σχέση με τα πλακίδια αναφοράς.