Διερεύνηση της δράσης των αντιμικροβιακών πεπτιδίων defensins ( alpha και beta) έναντι διαφόρων παθογόνων μικροοργανισμών

Abstract

Endogenous cationic antimicrobial peptides mediate innate immunity inevery species in which they have been investigated. Cathelicidins anddefensins are the two major families of antimicrobial peptides in mammals.They are abundant components of phagocytic leukocytes and are released byepithelial cells at mucosal surfaces. In the small intestine, Paneth cells at thebase of the crypts of Lieberkühn secrete α-defensins at high levels inresponse to cholinergic stimulation and when exposed to bacterial antigens.The release of Paneth cell products into the crypt lumen is inferred toprotect mitotically active crypt cells from colonization by potentialpathogens and confers protection from enteric infection. In addition, α-Defensins in Paneth cell secretions may interact with bacteria in theintestinal lumen above the crypt–villus boundary and influence thecomposition of the enteric microbial flora. Human b-defensins were alsodiscovered and characterized during the last decade. In particular, variousaspects of their gene location, expression patterns and the transcriptionfactors involved in their regulation in vivo have been extensively studied.Structural studies of β-defensins provide the molecular basis for a betterunderstanding of their properties, functions and their potential for practicalapplications. The antimicrobial activity of b-defensins, is clearly not theonly function of these peptides. Additional roles of human defensins includethe ability to act as chemokines as well as induce chemokine productionleading to recruitment of leukocytes to the site of infection, the promotionof wound healing and an ability tomodulate adaptive immunity. It appearsthat many of these properties are mediated though direct interaction ofpeptides with the cells of the innate immune response including monocytes,dendritic cells, T cells and epithelial cells. Although studies of theimmunomodulatory properties of these peptides are in their infancy, there isa growing body of evidence suggesting that the immunomodulatoryproperties of these small, naturally occurring molecules might be harnessedfor development as novel therapeutic agents. In our study we focused on157human β-defensin 2 (hBD-2), a 41-amino acid β-defensin. We determinedthe microbicidal activity of synthetic hBD-2 against nosocomial pathogensbelonging to 8 different bacterial and yeast species and exhibiting variousantimicrobial resistance phenotypes. The native disulfide connectivity wasfound essential for the bactericidal activity of hBD-2, while sodium chlorideconcentration was reversely associated with its potency. hBD-2 exhibitedhigh bactericidal activity against Acinetobacter baumannii, Pseudomonasaeruginosa, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium andStaphylococcus aureus clinical strains. Characteristically, A. baumanniistrains that exhibited multidrug-resistant phenotypes were susceptible tolowest concentrations of hBD-2 as compared with sensitive to antibiotics A.baumannii strains. Bactericidal activity of hBD-2 was less pronouncedagainst Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae and Proteus mirabils strainsbut was significantly enhanced against strains of these species that exhibitedresistance to several β-lactam antibiotics. These observations giveindications that the natural hBD-2 has a potential therapeutic role againstbacterial pathogens and particularly against those exhibiting multidrugresistantphenotypes.

Τα ενδογενή κατιονικά αντιμικροβιακά πεπτίδια αποτελούν σημαντικούςπαράγοντες της φυσικής ανοσίας σε όλα τα ζωικά είδη όπου έχουν βρεθείκαι μελετηθεί. Στα θηλαστικά χωρίζονται σε δύο κύριες οικογένειες, στιςcathelicidins και τις defensins. Υπάρχουν σε αφθονία στα λευκοκύτταρα καιστα επιθηλιακά κύτταρα των βλεννογόνων. Στο λεπτό έντερο, τα κύτταραPaneth των κρυπτών του Lieberkühn εκκρίνουν υψηλά επίπεδα α-defensinsσε απάντηση σε χολινεργική διέγερση ή σε έκθεση σε βακτηριακά αντιγόνα.Η απελευθέρωση των προϊόντων των κυττάρων Paneth στον αυλό τωνκρυπτών εξυπηρετεί την προστασία των μιτωτικά ενεργών κυττάρων τωνκρυπτών από αποικισμό τους από δυνητικά παθογόνα μικρόβια καιπροστατεύει τον οργανισμό από μια ενδεχόμενη εντερική λοίμωξη.Επιπρόσθετα, οι defensins που εκκρίνονται από τα κύτταρα Panneth πιθανώςαλληλεπιδρούν με τα βακτήρια που βρίσκονται στον εντερικό αυλόεπηρεάζοντας έτσι την σύνθεση της μικροβιακής εντερικής χλωρίδας. Οιανθρώπινες β-defensins ανακαλύφθηκαν και χαρακτηρίστηκαν κατά τηνδιάρκεια της τελευταίας δεκαετίας. Πιο συγκεκριμένα, στοιχεία πουαφορούν τα γονίδια τους, τα μοτίβα έκφρασης τους και τους μεταγραφικούςπαράγοντες που ενέχονται στην in vivo ρύθμιση τους έχουν μελετηθείεκτενώς. Δομικές μελέτες των β-defensins κατέδειξαν την μοριακή βάση τωνιδιοτήτων και λειτουργιών τους καθώς και την δυνατότητα πρακτικήςεφαρμογής τους. Η αντιμικροβιακή δράση των β-defensins δεν είναι σαφώςκαι η μόνη λειτουργία τους. Επιπρόσθετοι ρόλοι των β-defensinsπεριλαμβάνουν την δράση τους ως χημειοκίνες (και ως επαγωγοί τηςέκκρισης χημειοκινών) στρατολογώντας λευκοκύτταρα για να έρθουν στηνπεριοχή της λοίμωξης, την επαγωγή της επούλωσης των τραυμάτων και τηνρύθμιση της επίκτητης ανοσολογικής απόκρισης. Φαίνεται ότι πολλές απότις παραπάνω δράσεις επιτελούνται μέσω άμεσης αλληλεπίδρασης τωνπεπτιδίων με τα κύτταρα του συστήματος της φυσικής ανοσίας,συμπεριλαμβανομένων μονοκυττάρων, δενδριτικών κυττάρων, Τ-λεμφοκυττάρων και επιθηλιακών κυττάρων. Παρόλο που οι μελέτες τωνανοσορυθμιστικών ιδιοτήτων των defensins είναι σε πρωταρχικό επίπεδο,υπάρχουν ισχυρά δεδομένα που δηλώνουν ότι οι ανοσορυθμιστικές αυτώντων μικρών πεπτίδιων της φυσικής ανοσίας θα μπορούσαν να αποτελέσουντην βάση για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών. Στην παρούσα μελέτηεπικεντρωθήκαμε στην ανθρώπινη defensin (hBD-2), ένα κατιονικό πεπτίδιο41 αμινοξέων, με ευρύ φάσμα αντιμικροβιακής δράσης. Το αντικείμενοαυτής της διατριβής ήταν να προσδιορίστει η αντιμικροβιακή δράση τηςσυνθετικής hbd-2 ενάντια σε διαφορετικά νοσοκομειακά βακτηριακάστελέχη που ανήκουν σε 8 γένη/είδη με διαφορετικό φαινότυπο αντοχήςστα αντιβιοτικά. Παρατηρήθηκε ότι η δισουλφιδική συνδεσιμότητα είναιαπαραίτητη για τη βακτηριοκτόνο δράση της hBD-2 και ότι ηβακτηριοκτόνος δράση της είναι αντιστρόφως ανάλογη στη συγκέντρωσητου NACl. Η αντιμικροβιακή δράση της hBD-2 δοκιμάστηκε λεπτομερώςενάντια σε κλινικά απομονωθέντα στελέχη Klebsiella pneumonia, Ε. coli,Acinetobacter baumanni, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,Enterococcus faecalis και Enterococcus faecium. Πολυανθεκτικά στελέχηAcinetobacter baumanni πού απομονώθηκαν από τη μονάδα εντατικήςθεραπείας βρέθηκε να είναι ευαίσθητα σε χαμηλότερες συγκεντρώσειςhBD-2 από ότι ευαίσθητα στελέχη Acinetobacter baumanni. Ηβακτηριοκτόνος δράση της hBD-2 ήταν λιγότερο ισχυρή ισχυρή ενάντιαστα βακτήρια των ειδών Escherichia, Klebsiella και Proteus αλλά βρέθηκεενισχυμένη έναντι στελεχών των παραπάνω ειδών που ήταν ανθεκτικά σεδιάφορα β-λακταμικά αντιβιοτικά (κεφαλοσπορίνες, αζτρεονάμη καιαμοξυκιλλίνη + κλαβουλανικό). Τα ευρήματα μας υποδεικνύουν ότι τοφυσικό αντιβιοτικό πεπτίδιο hBD-2 μπορεί να παίξει σημαντικό θεραπευτικόρόλο ενάντια σε βακτηριακά παθογόνα και ειδικότερα ενάντια σεπολυανθεκτικά στελέχη αυτών.