Επανεργοποίηση της έκφρασης της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης με χημικές ουσίες σε in vitro και in vivo πειραματικά συστήματα

Abstract

Thalassaemia is one of the most common hereditary blood diseases resulting from reduced or absent production of one or more of the globin chains. The main experimental approaches for finding a cure are gene therapy and pharmacological reactivation of the gamma-globin gene which results in the production of foetal haemoglobin (HbF). This thesis is involved with the latter therapeutic approach.The principal aim of this work was to identify substances that induce the expression of the gamma-globin gene which is responsible for production of the gamma globin chain of foetal haemoglobin. The choice of substances to be studied was based either on their mechanism of action or on their chemical structure. All substances were initially studied in vitro in the GM979 cell system. Substances that had a positive activity in GM979 cells were subsequently studied ex vivo in cultures of erythroblast cells derived from healthy donors and thalassaemia patients. Substances of particular interest were then studied in vivo in transgenic mice. For the targeted synthesis of new derivatives with improved activity, a QSAR (Quantitative structure-activity relationship)software model was developed to processes the results of the screening of substances in GM979 cells and make predictions about changes in structure which can potentially improve their action. To study the molecular mechanism of action of HbF-inducing substances, chromatin immunoprecipitation (ChIP) experiments were employed.In the first part of the project 65 test substances were selected. These substances were classified into six different categories according to the main molecular mechanism of action: substances (and their derivatives) that cause hypomethylation, inhibitors of histone deacetylation, compounds that bind to DNA, anthracyclines, inhibitors of ribonucleotide reductase and substances which are antioxidants, metabolites or drugs that affect metabolic pathways. In summary, of the 65 substances studied, 13 were active in the GM979 cell system. Of those 13 positive substances, eight were active in BFUe cells from healthy individuals. Six out of these eight substances were also active in BFUe cells from thalassaemic donors. Importantly, these substances had even higher activity in some of the patient cultures than hydroxyurea. The six substances are: oxamflatin, 5-fluoro2'deoxyuridine, diammine-dinitritoplatinum, daunorubicin, idarubicin and 3,3 '5-triodo-L-Thryonine. Daunorubicin was selected for further screening in transgenic mice where it caused a significant increase in gamma-globin mRNA, gamma-globin chains and the number of F cells. Further studies on the mechanism of action of these compounds will shed more light on their suitability as potential pharmacological agents for the treatment of β-thalassaemia while screening of more derivatives of these drugs will help in identifying more effective drugs.Studies of the mechanism of action of mithramycin and oxamflatin showed that mithramycin causes a reduction in the binding of transcription factor Sp1 to selected regulatory regions of the Locus Control Region (LCR) and that oxamflatin causes an increase in the acetylation of regulatory regions in the γ-globin gene and the LCR.Chemical modification and synthesis of derivatives of MS-275, one of the active substances tested, was carried out as part of this project in combination with the virtual screening of the synthetic derivatives using a QSAR model aiming to improve the action and reduce the cytotoxicity of test substances. 26 new derivatives were chemically synthesised. Only one of the newly synthesised chemical derivatives, CRC144, was both non-toxic and had comparable activity to MS275 at the same concentration.

Η θαλασσαιμία είναι μια από τις πιο συχνές κληρονομικές ασθένειες του αίματος κατά την οποία παρατηρείται μειωμένη ή καθόλου παραγωγή μίας ή περισσότερων αλυσίδων της αιμοσφαιρίνης. Μια ερευνητική προσέγγιση για την θεραπεία της θαλασσαιμίας είναι η επανεργοποίηση της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης. Με αυτή την θεραπευτική προσέγγιση καταπιάνεται η παρούσα διατριβή.O βασικός σκοπός της εργασίας είναι η εύρεση ουσιών που επάγουν την έκφραση του γ-γονιδίου υπεύθυνου για την παραγωγή της γ-σφαιρίνης της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης. Η επιλογή των ουσιών που μελετήθηκαν βασίστηκε είτε στον μηχανισμό δράσης τους είτε στη χημική τους δομή. Όλες οι ουσίες μελετήθηκαν αρχικά in vitro στο κυτταρικό σύστημα GM979. Οι ουσίες που ήταν θετικές στα κύτταρα GM979 μελετήθηκαν ακολούθως ex vivo σε καλλιέργειες ερυθροβλαστικών κυττάρων από υγιή άτομα και θαλασσαιμικούς δότες. Ουσίες με ιδιαίτερο ενδιαφέρον μελετήθηκαν στη συνέχεια in vivo σε διαγονιδιακά ποντίκια. Για τη στοχευόμενη σύνθεση παραγώγων με βελτιωμένη δράση αναπτύχθηκε ένα λογισμικό μοντέλο QSAR που κάνει προβλέψεις για τις αλλαγές στη δομή για τις οποίες μπορεί να βελτιωθεί η δράση τους. Για την μελέτη του μοριακού μηχανισμού των δραστικών ουσιών έγιναν πειράματα με ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης. Οι ουσίες κατατάσσονται σε 6 κατηγορίες ανάλογα με το κύριο μοριακό μηχανισμό δράσης τους. Στην μελέτη συμπεριλαμβάνονται ουσίες που προκαλούν υπομεθυλίωση και παράγωγα τους, καταστολείς της αποκετυλάσης των ιστονών, ουσίες που συνδέονται στο DNA, ανθρακυκλίνες, καταστολείς της ριβονουκλεοτιδικής αναγωγάσης και ουσίες που είναι είτε αντιοξειδωτικές ή μεταβολίτες ή ουσίες που επηρεάζουν μεταβολικά μονοπάτια. Από τις 65 ουσίες που μελετήθηκαν σε αυτή την εργασία, έχουν βρεθεί 13 θετικές ουσίες. Από τις 13 θετικές ουσίες που μελετούνται για πρώτη φορά, 8 είχαν θετική δράση σε κύτταρα ερυθροβλαστών από υγιή άτομα. Οι 6 από τις 8 αυτές ουσίες ήταν δραστικές και σε κύτταρα ερυθροβλαστών από θαλασσαιμικούς δότες και μάλιστα σε κάποια δείγματα η αύξηση που προκάλεσαν ήταν μεγαλύτερη από την αντίστοιχη που προκάλεσε η υδροξυουρία. Οι ουσίες αυτές ήταν οι: Oxamflatin (καταστολείς της αποακετυλάσης των ιστονών), 5-Fluoro2’deoxyuridine (ουσίες που προκαλούν υπομεθυλίωση και παράγωγα), Diammine-dinitritoplatinum (ουσίες που συνδέονται στο DNA), Daunorubicin, Idarubicin (Ανθρακυκλίνες), 3,3’5-Triodo-L-Thryonine (ουσίες που επηρεάζουν μεταβολικά μονοπάτια).Μελέτη του μηχανισμού δράσης της Mithramycin (ουσίες που συνδέονται στο DNA) και του Oxamflatin έδειξε ότι η Mithramycin προκαλεί μείωση στη σύνδεση του μεταγραφικού παράγοντα Sp1 σε επιλεγμένες ρυθμιστικές περιοχές του LCR ενώ το Oxamflatin προκαλεί αύξηση στην ακετυλίωση ρυθμιστικών περιοχών στο γ-γονίδιο και το LCR. Έγινε επίσης χημική τροποποίηση και σύνθεση παραγώγων της θετικής ουσίας MS-275 σε συνδυασμό με τον εικονικό έλεγχο των συνθετικών παραγώγων με το μοντέλο ποσοτικής συσχέτισης δομής-λειτουργίας QSAR (quantitative structure-activity relationships) με στόχο την βελτίωση της δράσης τους και μείωση της κυτταροτοξικότητας τους. Έγινε σύνθεση 26 παραγώγων. Το CRC 144 ήταν το μόνο παράγωγο που είχε παραπλήσια δράση στην ίδια συγκέντρωση με το MS275 και χωρίς να είναι τοξικό.