Μελέτη των φυλογενετικών σχέσεων των χρωμοσωματικών φυλών του υπόγειου σκαπτοποντικού Microtus thomasi με κυτταρογενετικές και μοριακές μεθόδους

Abstract

During the current PhD project, the phylogenetic relationships of the chromosomal races of the underground vole Microtus thomasi were examined through cytogenetic and molecular approaches. In total, 408 voles were collected from 65 localities of Greece, Albania and Montenegro, in order to clarify their phylogenetic relationships with classical cytogenetic techniques (G and C banding), comparative cytogenetic analysis with telomeric and satellite markers, molecular phylogeny with markers mtDNA markers (cytb, D-loop) and hybridization experiments between voles from distinct chromosomal races. Our results indicate that the voles from Attiki and Evia seem to be differentiated from other populations, based in all applied approaches. In this context, we propose that the populations from Attiki and Evia should be considered as a distinct species, validating the species name Microtus atticus, as it has been originally described by Miller at 1910. The two sibling species, Microtus thomasi and Microtus atticus have karyotypes with similar G and C banding pattern, but differ in the content of the X chromosome heterochromatin (mainly Mth-Alu900 satellite sequence in M. atticus, telomeric repeats in M. thomasi), appear reproductively isolated (produce sterile F1 hybrids when crossed in laboratory conditions) and the between species genetic distances were calculated similar to other closely related Microtus species (2,7% for cytb and 2,6% for D-loop). The two species demonstrate an extensive chromosomal polymorphism, resulting in the description of nine chromosomal races in M. thomasi: “thomasi” (2n=44, FN=44), “peloponnesiacus" (2n=44, FN=46), “Tichio” (2n=42, FN=44), “Rb-subalpine”(2n=40, FN=42), “subalpine” (2n=42, FN=42), “Preveza” (2n=40, FN=42), “Kali” (2n=40, FN=42), “Aridea” (2n=38, FN=42), “Edessa”(2n=38, FN=40) and two chromosomal races in M. atticus: "atticus" (2n=44, FN=46), "Evia" (2n=44, FN=44).Based on the results from the hybridization experiments, the molecular phylogenetic and the cytogenetic analysis, we proceed to the re-evaluation of the known chromosomal races and the description of new chromosomal races. The voles from Attiki and Peloponnesus, which were described to the "atticus" chromosomalΒ. Abstract6race of the species M. thomasi according to previous publications, are distinguished in two races, which are attributed to distinct species. In fact, the voles from Attiki are attributed to "atticus" race and classified in M. atticus, while the voles from Peloponnesus are attributed to a new race, named "peloponnesiacus" and classified to M. thomasi. The race "atticus", consisting of the populations from Attiki and Peloponnesus according to previous studies, was distinguished in two distinct, reproductively isolated races: "atticus" (2n=44, FN=46) (populations from Attiki) attributed to M. atticus, and "peloponnesiacus" (2n=44, FN=46) (populations from Peloponnesus), attributed to M. thomasi. Furthermore, we described four chromosomal races (“Tichio”, “Preveza”, “Kali” και "Edessa") in the species M. thomasi, which were referred in previous works as chromosomal polymorphisms. In the same context, we described for first time the chromosomal race "Aridea" (2n=38, FN=42) in the species M. thomasi and the chromosomal race "Evia" (2n=44, FN=44) in the species M. atticus.The chromosome races "atticus" of the species M. atticus and "peloponnesiacus", "subalpine", "Kali" and "Edessa" of the species M. thomasi, were crossed in laboratory conditions with the most primitive form "thomasi" of the species M. thomasi. The voles from the chromosomal race "atticus" (M. atticus) produced sterile F1 hybrids, when crossed with voles from the chromosomal races "thomasi" and "peloponnesiacus" (M. thomasi). The voles from the chromosomal race "subalpine" produced fully fertile hybrids in F1, F2 and backcrosses generations, when crossed with the voles from the chromosomal race "thomasi". On the contrary, the voles from the chromosomal races "Kali" and "Edessa" produced sterile hybrids in F2 and F1 generations, when crossed with the voles from the chromosomal race "thomasi", despite the fact that all three races belong to the same species. The reproductive isolation of the chromosomal races "Kali" and "Edessa" could be attributed to chromosomal incompatibilities and indicates that the genetic differentiation of the chromosomal races could eventually lead to speciation.Based on the geographical traits of the Southern Balkans and the comparative interpretation of our results, we are able to present a possible scenario of the evolutionary history of the chromosomal races of the species M. thomasi and M. atticus. We assume that the primitive form was distributed in a glacial refugium ofΒ. Abstract7Southern Greece, during the last Glacial period (10.000-125.000 BP). Due to ecological or/and climatological factors, the ancestral population was separated in two subpopulations, which evolved to distinct species. At the end of the last glacial period, the global warming allowed the voles of M. thomasi to expand northwards to the Balkans, colonizing unoccupied areas of Greece, Albania and Montenegro and establishing all known chromosomal races. On the contrary, the changes of the landscape, due to the rise of the sea level and the separation of Evia Island from the Greek mainland, further isolated the M. atticus populations in Attiki and Evia, prohibiting the northwards colonization

Στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής μελετήθηκαν οι φυλογενετικές σχέσεις των χρωμοσωματικών φυλών του είδους M. thomasi με κυτταρογενετικές και μοριακές προσεγγίσεις. Συλλέχθηκαν συνολικά 408 άτομα από 65 τοποθεσίες της Ελλάδας, της Αλβανίας και του Μαυροβουνίου, που μελετήθηκαν με κλασικές κυτταρογενετικές μεθόδους (πρότυπο G & C ζώνωσης), συγκριτική μοριακή κυτταρογενετική ανάλυση με δείκτες τελομερικές και δορυφορικές αλληλουχίες, μοριακή φυλογένεση με δείκτες μιτοχονδριακούς γενετικούς τόπους (cytb, D-loop) και εργαστηριακές διασταυρώσεις ανάμεσα σε άτομα από διαφορετικές χρωμοσωματικές φυλές. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής δείχνουν ότι οι σκαπτοποντικοί από την Αττική και την Εύβοια παρουσιάζουν σημαντικές διαφορές σε σχέση με τους υπόλοιπους πληθυσμούς, σε όλες τις προσεγγίσεις που χρησιμοποιήθηκαν και προτείνεται να θεωρηθούν ως διακριτό είδος με το όνομα Microtus atticus, όπως είχε αρχικά περιγραφεί από τον Miller το 1910. Τα δύο αδελφά είδη M. thomasi και M. atticus έχουν παρόμοιο πρότυπο C και G ζώνωσης στα αυτοσωματικά χρωμοσώματα, αλλά διαφέρουν ως προς την σύσταση της ετεροχρωματίνης των Χ χρωμοσωμάτων (στο Μ. atticus αποτελείται κυρίως από τη δορυφορική αλληλουχία Mth-Alu900, ενώ στο M. thomasi από τελομερικές αλληλουχίες), παρουσιάζουν αναπαραγωγική απομόνωση (σε εργαστηριακές συνθήκες δίνουν στείρα F1 υβρίδια) και παρουσιάζουν γενετικές αποστάσεις, παραπλήσιες με άλλα στενά συγγενικά είδη Microtus ως προς τους μιτοχονδριακούς γενετικούς τόπους (cytb: 2,7% και D-loop: 2,6%). Τα δύο παραπάνω είδη παρουσιάζουν εκτεταμένους χρωμοσωματικούς πολυμορφισμούς που ομαδοποιούνται σε εννέα χρωμοσωματικές φυλές στο είδος M. thomasi: “thomasi” (2n=44, FN=44), “peloponnesiacus" (2n=44, FN=46), “Tichio” (2n=42, FN=44), “Rb-subalpine”(2n=40, FN=42), “subalpine” (2n=42, FN=42), “Preveza” (2n=40, FN=42), “Kali” (2n=40, FN=42), “Aridea” (2n=38, FN=42), “Edessa”(2n=38, FN=40) και δύο φυλές στο είδος M. atticus: "atticus" (2n=44, FN=46), "Evia" (2n=44, FN=44).Α. Περίληψη2Με βάση τα αποτελέσματα των εργαστηριακών διασταυρώσεων, τη φυλογενετική και την κυτταρογενετική μελέτη, πραγματοποιήθηκε μία εκτεταμένη αναθεώρηση της προέλευσης των ήδη γνωστών χρωμοσωματικών φυλών, ενώ βρέθηκαν και περιγράφηκαν νέες χρωμοσωματικές φυλές. Οι πληθυσμοί σκαπτοποντικών από την Αττική και την Πελοπόννησο, που σύμφωνα με παλαιότερες εργασίες, είχαν περιγραφεί ως "atticus" και άνηκαν στο είδος M. thomasi, στην παρούσα διδακτορική διατριβή διαχωρίζονται σε δύο χρωμοσωματικές φυλές, που κατατάσσονται στα δύο διαφορετικά είδη. Οι πληθυσμοί από την Αττική ανήκουν στη φυλή "atticus" και κατατάσσονται στο είδος M. atticus, ενώ οι πληθυσμοί σκαπτοποντικών από την Πελοπόννησο θεωρούνται ως μία διακριτή φυλή, την "peloponnesiacus" και κατατάσσονται στο είδος M. thomasi. Οι χρωμοσωματικές φυλές του είδους M. thomasi: “Tichio”, “Preveza”, “Kali” και "Edessa" που είχαν αναφερθεί ως πολυμορφισμοί σε παλαιότερες εργασίες, περιγράφονται πια ως διακριτές χρωμοσωματικές φυλές. Επίσης, περιγράφονται για πρώτη φορά η χρωμοσωματική φυλή “Aridea” (2n=38, FN=42) του είδους M. thomasi και η χρωμοσωματική φυλή "Evia" (2n=44, FN=44) του είδους M. atticus. Οι χρωμοσωματικές φυλές "atticus" του είδους M. atticus και "peloponnesiacus", "subalpine", "Kali" και "Edessa" του είδους M. thomasi διασταυρώθηκαν στο εργαστήριο με την θεωρούμενη ως πιο πρωτόγονη φυλή "thomasi" του είδους M. thomasi. Η χρωμοσωματική φυλή "atticus", που ανήκει στο είδος M. atticus, έδωσε στείρους απογόνους με τις φυλές "peloponnesiacus" και "thomasi", που ανήκουν στο είδος M. thomasi. Οι σκαπτοποντικοί της φυλής "subalpine" έδωσαν γόνιμους απογόνους στην F1 γενεά, στην F2 γενεά και στις ανάδρομες διασταυρώσεις, όταν διασταυρώνονται με σκαπτοποντικούς της φυλής "thomasi". Αντίθετα, οι σκαπτοποντικοί της φυλής "Kali" έδωσαν στείρους απογόνους στην F2 γενεά, ενώ οι σκαπτοποντικοί της φυλής "Edessa" έδωσαν στείρους απογόνους στην F1 γενεά, όταν διασταυρώνονται με σκαπτοποντικούς της φυλής "thomasi", αν και ανήκουν στο ίδιο είδος. Η αναπαραγωγική απομόνωση των φυλών "Kali" και "Edessa", από τη φυλή "thomasi" οφείλεται σε χρωμοσωματικές ασυμβατότητες και αποτελεί ένδειξη ότι η γενετική διαφοροποίηση των χρωμοσωματικών φυλών μπορεί να οδηγήσει υπό προϋποθέσεις σε ειδογένεση.Α. Περίληψη3Με βάση την παλαιογεωγραφία του ελληνικού χώρου και την συγκριτική ερμηνεία των αποτελεσμάτων που προέκυψαν από όλες τις προσεγγίσεις, παρουσιάζεται ένα πιθανό σενάριο της εξελικτικής ιστορίας των χρωμοσωματικών φυλών των ειδών M. thomasi και M. atticus. Υποθέτουμε ότι η προγονική μορφή των δύο ειδών βρισκόταν σε παγετώδες καταφύγιο της Νότιας Ελλάδας κατά την τελευταία παγετώδη περίοδο (πριν από 10.000-125.000 χρόνια). Εξαιτίας οικολογικών ή/και παλαιοκλιματολογικών παραγόντων, ο αρχικός πληθυσμός διασπάστηκε σε δύο υποπληθυσμούς, που σταδιακά διαφοροποιήθηκαν σε διακριτά είδη. Με το τέλος της πρόσφατης παγετώδους περιόδου, η σταδιακή βελτίωση των κλιματολογικών συνθηκών, επέτρεψε στο είδος M. thomasi να αποικίσει την Κεντρική και Βόρεια Ελλάδα, την Αλβανία και το Μαυροβούνιο, όπου διαμορφώθηκαν σταδιακά όλες οι γνωστές χρωμοσωματικές φυλές. Αντίθετα, οι αλλαγές στο ηπειρωτικό ανάγλυφο, όπως η άνοδος της στάθμης της θάλασσας και ο αποχωρισμός της Εύβοιας από την Στερεά Ελλάδα, απομόνωσαν το είδος M. atticus στην περιοχή της Αττικής και της Εύβοιας αποτρέποντας την περαιτέρω εξάπλωσή του