Παραγωγή πολυ - υδροξυαλκανεστέρων ( PHAs) από καθαρές και μικτές καλλιέργειες μικροοργανισμών με χρήση συνθετικών υποστρωμάτων και υγρών αποβλήτων ελαιοτριβείου

Abstract

During the last years the widespread use of plastic materials combined with the fact that even after their disposal these materials remain in the environment for many years, has caused one of the major environmental problems worldwide. For this reason special emphasis has been given to the development of materials which have the ability to degrade in the environment in which they are disposed and are called biodegradable polymers. Among the various types of materials that are induced in this category the group of Poly-hydroxyalkanoates (PHAs) attracts great interest.More than 300 strains of microorganisms have been characterized for their ability to synthesize and accumulate these polymers as carbon and energy storage. PHAs are accumulated in the form of intracellular inclusions (granules) when the microbial faces dynamic conditions which have to do with a lack of a useful for microbial growth component. Such conditions are achieved by providing a growth-limiting the medium in nitrogen, phosphorus, magnesium, sulfur, oxygen in the presence of excess carbon source which microorganisms use as precursor for PHAs production..In the present thesis a mixed culture of microorganisms capable of producing PHAs was developed using activated sludge. The enrichment of the culture to PHAs forming bacteria took place in a draw ‘n fill reactor and the culture was submitted to alternating cycling between limitation of carbon and nitrogen substrates.After several cycles of operation under the above-mentioned conditions, the behavior of the culture seemed to stabilize and the microbial consortium that represented the ‘enriched’ culture was identified via real-time polymerase chain reaction (PCR). Six different strains were isolated which were found to belong to the Pseudomonas genus. . The isolated strains and the ‘enriched’ culture were subsequently studied in terms of PHAs accumulation capacity under aerobic, nitrogen-limiting conditions as well as under dual nitrogen and oxygen limiting conditions. In these cases the carbon source used was a synthetic mixture of acetate, propionate and butyrate as well as acidified olive oil mill wastewater (outflow of mesophilicixreactor used for biohydrogen production) which was rich in volatile fatty acids. According to experimental data obtained, the ‘enriched’ mixed culture gave the best results in terms of PHAs accumulation and yield and was consequently selected for further investigation.Subsequently, batch experiments were performed in order to investigate the optimal conditions for PHAs production by the ‘enriched’ mixed culture using synthetic substrates i.e. acetic, propionic and butyric acid. Specifically, (a) the influence of the initial pH using as carbon source a mixture of acetic, propionic and butyric acid (g/l 1:1:1) was studied, (b) the effect of the carbon source in the distribution of metabolic products using either acetic or propionic or butyric acid and all possible combinations thereof was studied and (c) the effect of the ratio c / N in the medium using as carbon source a mixture of acetic, propionic and butyric acid (g/l 1:1:1) was studied. Furthermore, the microbial growth through consumption of intracellular accumulated PHAs using extracellular nitrogen source with simultaneous absence of a carbon source was investigated as well as the intracellular biodegradation of PHAs for biomass maintenance.By using the MATLAB software it was attempted to simulate and predict both the consumption of the carbon source and the distribution of PHAs produced in the experiments related to the production of PHAs from different carbon sources.Finally, in an effort to reduce the cost of the substrate which reduces the cost of produced PHAs, we investigated the use of acidified olive mill wastewater in a continuous SBR type reactor.

Κατά την διάρκεια των τελευταίων χρόνων η εκτεταμένη χρήση των πλαστικών υλικών σε συνδυασμό με το γεγονός πως ακόμη και μετά την διάθεση τους τα υλικά αυτά παραμένουν στο περιβάλλον για πολλά χρόνια, έχει προκαλέσει ένα από τα σημαντικότερα περιβαλλοντικά προβλήματα σε παγκόσμια κλίμακα. Για τον λόγο αυτό ιδιαίτερη έμφαση έχει δοθεί στην ανάπτυξη υλικών τα οποία έχουν την ικανότητα να αποδομούνται από το περιβάλλον στο οποίο διατίθενται και ονομάζονται βιοδιασπώμενα πολυμερή. Μεταξύ των διαφόρων τύπων υλικών που επάγονται σε αυτή την κατηγορία μεγάλο ενδιαφέρον έχει προκαλέσει η ομάδα των πολύ-υδροξυαλκανεστέρων (Poly-hydroxyalkanoates: PHAs).Περισσότερα από 300 στελέχη μικροοργανισμών έχουν χαρακτηριστεί ως προς την ικανότητα τους να συνθέτουν και να συσσωρεύουν τα πολυμερή αυτά ως αποθήκη άνθρακα και ενέργειας. Η συσσώρευση των PHAs πραγματοποιείται με την μορφή ενδοκυτταρικών εγκλεισμάτων όταν ο μικροβιακός πληθυσμός καλείται να ανταπεξέλθει κάτω από δυναμικές συνθήκες οι οποίες έχουν να κάνουν με την έλλειψη ενός χρήσιμου για την μικροβιακή ανάπτυξη συστατικού. Τέτοιες συνθήκες επιτυγχάνονται με περιορισμό του θρεπτικού μέσου σε άζωτο, φωσφόρο, μαγνήσιο, θείο, οξυγόνο ενώ υπάρχει υπερεπάρκεια όσον αφορά την πηγή άνθρακα την οποία οι μικροοργανισμοί θα χρησιμοποιήσουν ως υπόστρωμα για την παραγωγή PHAs.Στην παρούσα διατριβή αναπτύχτηκε μικτή καλλιέργεια μικροοργανισμών ικανών για παραγωγή PHAs χρησιμοποιώντας δραστική λάσπη ως πρώτη ύλη. Ο εμπλουτισμός της καλλιέργειας σε ΡΗΑ-συσσωρευτικά βακτήρια πραγματοποιήθηκε σε αντιδραστήρα περιοδικής πλήρωσης και απορροής (draw ‘n fill reactor) ενώ η στρατηγική εμπλουτισμού που ακολουθήθηκε ήταν η εναλλαγή μεταξύ περιοριστικών υποστρωμάτων άνθρακα και αζώτου στο θρεπτικό μέσο.Η ‘εμπλουτισμένη’ μικτή καλλιέργεια χαρακτηρίστηκε όσον αφορά τα κυρίαρχα στελέχη που την απαρτίζουν μέσω τεχνικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction - PCR). Έξι διαφορετικά στελέχη απομονώθηκαν τα οποία βρέθηκαν να ανήκουν στο γένος Pseudomonas. Κάθε ένα από αυτά μαζί με την μικτή καλλιέργεια μελετήθηκαν ως προςviiτην ικανότητα τους να παράγουν PHAs τόσο σε αερόβιες συνθήκες απουσίας αζώτου όσο και σε συνθήκες απουσίας αζώτου με ταυτόχρονο περιορισμό σε οξυγόνο. Στις παραπάνω περιπτώσεις ως πηγή άνθρακα χρησιμοποιήθηκε συνθετικό μίγμα πτητικών λιπαρών οξέων (οξικό, προπιονικό, βουτυρικό) καθώς επίσης και οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου (εκροή μεσόφιλου υδρογονοπαραγωγού αντιδραστήρα) πλούσιο σε πτητικά λιπαρά οξέα. Σύμφωνα με τα πειραματικά δεδομένα η μικτή καλλιέργεια έδωσε τα καλύτερα αποτελέσματα όσον αφορά τα ποσοστά συσσώρευσης και τους συντελεστές απόδοσης σε PHAs οπότε και προτιμήθηκε η χρήση και η περαιτέρω μελέτη της συμπεριφοράς της.Στην συνέχεια πραγματοποιήθηκαν πειράματα διαλείποντος έργου για την διερεύνηση των βέλτιστων συνθηκών παραγωγής PHAs από την εμπλουτισμένη καλλιέργεια χρησιμοποιώντας συνθετικά υποστρώματα δηλαδή οξικό, προπιονικό και βουτυρικό οξύ. Συγκεκριμένα μελετήθηκε: (α) η επίδραση του αρχικού pH χρησιμοποιώντας ως πηγή άνθρακα μίγμα οξικού, προπιονικού και βουτυρικού οξέος (g/l 1:1:1), (β) η επίδραση της πηγής άνθρακα στην κατανομή των μεταβολικών προϊόντων χρησιμοποιώντας είτε οξικό είτε προπιονικό είτε βουτυρικό οξύ καθώς και τους πιθανούς συνδυασμούς αυτών και (γ) η επίδραση του λόγου C/N στο θρεπτικό μέσο χρησιμοποιώντας ως πηγή άνθρακα μίγμα οξικού, προπιονικού και βουτυρικού οξέος (g/l 1:1:1). Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε μελέτη της ανάπτυξης της κυτταρικής βιομάζας μέσω της κατανάλωσης των ενδοκυτταρικά συσσωρευμένων PHAs παρουσία εξωκυτταρικής πηγής αζώτου με ταυτόχρονη απουσία πηγής άνθρακα καθώς και η ενδοκυτταρική βιοαποδόμηση των PHAs για λόγους συντήρησης της βιομάζας.Κάνοντας χρήση του λογισμικού πακέτου MATLAB επιχειρήθηκε η πρόβλεψη τόσο της κατανάλωσης της πηγής άνθρακα όσο και της κατανομής των παραγόμενων PHAs στα πειράματα που αφορούν την παραγωγή των PHAs από διαφορετικές πηγές άνθρακα.Τέλος, σε μια προσπάθεια μείωσης του κόστους του υποστρώματος η οποία συνεπάγεται μείωση του κόστους των παραγόμενων PHAs, διερευνήθηκε η εκμετάλλευση οξυνισμένου αποβλήτου ελαιοτριβείου το οποίο ήταν προϊόν εκροής μεσόφιλου υδρογονοπαραγωγού αντιδραστήρα σε αντιδραστήρα συνεχούς λειτουργίας τύπου SBR.