Αρνητική ρύθμιση της μεταβίβασης του σήματος της αυξητικής ορμόνης σε παιδιά με ανεπάρκεια αύξησης

Abstract

Growth Hormone (GH) plays an important role in postnatal linear growth, skeletal development, protein, lipid and carbohydrate metabolism, bone turnover and immune function. Defects in the GH secretion and function in children can cause growth retardation. Several clinical entities of growth retardation have been described, including defects in pituitary GH secretion, spontaneous 24h GH secretion, GH receptor number or function, post-receptor signaling and IGF-I synthesis or function. In this study, one patient with Growth Hormone Transduction Defect (GHTD) was studied. GHTD is characterized by severe short stature with normal provoked and spontaneous GH secretion, low IGF-I concentrations, impaired phosphorylation of the transcriptional factor STAT3 and overexpression of the cyclin-dependent kinase inhibitor, p21. Furthermore, GHTD patients have significantly increased IGF-I concentrations after induction with hGH during the IGF-I generation test, and significant ‘catch-up’ growth after hGH therapy. No mutations were found in STAT3, GHR and GH1 gene in the GHTD patients. Primary fibroblast cultures were established from gingival biopsies obtained from the GHTD patient and one control. The GH signaling molecules and the negative regulators of GH were studied, as well as the role of protein CIS in the impaired GH signaling and the effect of CIS silencing on GH signaling. Furthermore, the possible crosstalk between the GH and EGF signaling cascades was examined, as well as its role in the restoration of the impaired GH signaling and the clinical response after therapy with exogenous hGH. The protein expression of the studied molecules was studied by Western Immunoblotting, their cellular localization by Immunofluoresence and the protein-protein interactions by Co-immunoprecipitation. The results of this study support the hypothesis that impaired GH signaling in GHTD children is mediated by the overexpression of ubiquitinated CIS, which causes rapid and excessive translocation of the GHR to the proteasomes for degradation. The results also showed that the restoration of physiological GH signaling after the silencing of CIS involves the restoration of the GHR to the plasma membrane for normal activation by GH, as well as the activation of the EGFR pathway. In addition, there is vigorous crosstalking between the GH and EGF signaling pathways during exogenous hGH treatment in the GHTD children, resulting in the accelerated growth seen in these children after hGH therapy.

Η Αυξητική ορμόνη παίζει σημαντικό ρόλο στη μεταγεννητική κατά μήκος αύξηση, στη σκελετική ανάπτυξη, στο μεταβολισμό πρωτεϊνών, λιπών και υδατανθράκων, στην οστική ανακύκλωση και την ανοσιακή λειτουργία. Διαταραχή στην έκκριση ή στη δράση της ορμόνης στα παιδιά προκαλεί, μεταξύ άλλων, ανεπάρκεια αύξησης. Έχουν περιγραφεί αρκετές κλινικές οντότητες ανεπάρκειας αύξησης, που οφείλονται κυρίως σε διαταραχές στην υποφυσιακή έκκριση GH, στην 24ωρη αυθόρμητη έκκριση της GH, στον αριθμό ή τη λειτουργία των υποδοχέων GHR, στη μετά τον υποδοχέα μεταβίβαση του σήματος της GH και στη σύνθεση ή δράση του IGF-I. Η παρούσα μελέτη εξέτασε έναν ασθενή με Διαταραχή στη Μεταγωγή του Σήματος της GH (Growth Hormone Transduction Defect/GHTD). Η οντότητα αυτή χαρακτηρίζεται από σοβαρό κοντό ανάστημα με φυσιολογικές δοκιμασίες φαρμακολογικής πρόκλησης, φυσιολογικές τιμές 24ωρης έκκρισης GH, χαμηλά επίπεδα IGF-I, διαταραχή στη φωσφορυλίωση του μεταγραφικού παράγοντα STAT3 και υπερέκφραση του αναστολέα του κυτταρικού κύκλου p21. Επιπλέον, οι ασθενείς με GHTD παρουσιάζουν σημαντικά αυξημένα επίπεδα IGF-I μετά από επαγωγή με hGH κατά τo IGF-I generation test και σημαντική αναπλήρωση αύξησης μετά από θεραπεία με hGH. Επίσης, χαρακτηρίζονται από απουσία μεταλλάξεων στην πρωτεΐνη STAT3, στον υποδοχέα GHR και στο γονίδιο GH1. Χρησιμοποιήθηκαν πρωτογενείς καλλιέργειες ινοβλαστών από ούλα του προς μελέτη ασθενή κι ενός μάρτυρα. Μελετήθηκαν σηματοδοτικά μόρια του μεταγωγικού μονοπατιού της GH και του μονοπατιού αρνητικής ρύθμισης, και διερευνήθηκε ο ρόλος της πρωτεΐνης CIS στην παθολογική μεταβίβαση του σήματος της GH στον ασθενή, καθώς και η επίδραση της καταστολής του γονιδίου CIS στη σηματοδότηση της GH. Επίσης, διερευνήθηκε η πιθανή διασυνομιλία ανάμεσα στα σηματοδοτικά μονοπάτια της GH και του EGF, καθώς και ο ρόλος της διασυνομιλίας αυτής στην αποκατάσταση της φυσιολογικής σηματοδότησης της GH και, κατ’επέκταση, στην κλινική ανταπόκριση μετά από θεραπεία με εξωγενώς χορηγούμενη ανθρώπινη βιοσυνθετική ορμόνη, παιδιών με GHTD. Η πρωτεϊνική έκφραση των μελετηθέντων πρωτεϊνών μελετήθηκε με ανοσοαποτύπωση κατά Western, η κυτταρική εντόπισή τους με ανοσοφθορισμό και η διαντίδραση ορισμένων από τις πρωτεΐνες με ανοσοσυγκατακρήμνιση. Τα ευρήματα της εργασίας στοιχειοθετούν την αρχική υπόθεση ότι η διαταραγμένη μεταβίβαση του σήματος της GH στα παιδιά με GHTD διαμεσολαβείται μέσω της υπερέκφρασης της ουβικουιτινυλιωμένης μορφής της πρωτεΐνης CIS, η οποίθα προκαλεί ραγδαία και εκσεσημασμένη μεταφορά του GHR στο πρωτεάσωμα για αποδόμηση. Τα αποτελέσματα επίσης έδειξαν ότι η αποκατάσταση της φυσιολογικής σηματοδότησης της GH μετά τη σίγαση του γονιδίου CIS περιλαμβάνει την επαναφορά του GHR στην κυτταροπλασματική μεμβράνη για φυσιολογική ενεργοποίηση από την GH, καθώς και την ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού του EGFR. Επιπροσθέτως, υπάρχει έντονη διασυνομιλία μεταξύ των σηματοδοτικών μονοπατιών της GH και του EGF κατά τη χορήγηση εξωγενούς hGH στα παιδιά με GHTD, με αποτέλεσμα την επιτάχυνση της αύξησης που παρατηρείται στα παιδιά αυτά μετά από θεραπεία με hGH.