Η επίδραση της δικλοφενάκης και σιμβαστατίνης στην επούλωση οστικών ελλειμμάτων: πειραματική μελέτη

Abstract

NSAlDs and statins are two widely prescribed drug classes that differentially affect bone healing and bone formation, positively or negatively. Scientific data on this subject remains inconclusive, hence the aim of this study is to elucidate the effect of diclofenac and simvastatin in artificial bone defect healing. Among the NSAIDs diclofenac was chosen (Voltaren®: Novartis Hellas), which was intramuscularly administered in a dose of 5 mg/kg BW/day for a given period of time. Among statins simvastatin was studied (Sigma-Aldrich, USA), which was administered systematically and locally. Simvastatin was dissolved in water for injection (WFI) or in 50% v/v DMSO in WFI and intraperitoneal^ administered in a dose of 10 mg/kg BW daily for a given period of study. Local administration included a solution of simvastatin dissolved in WFI or in a DMSO solution and administered in a dose of 0 5 mg in each defect. 144 male Wistar rats weighing -350 g were employed. Two parietal bone defects were formed in each rat, hence a total of 288 bone defects were studied, out of which 195 were ultimately used for histological evaluation. Specimens were divided into 7 main groups with respect to i) the route of administration of the pharmacological agents under study and ii) the method of defect healing (with or without collagen membrane) and 18 subgroups with respect to the study duration that was either 2, 4 or 8 weeks. The following experimental methods were used: Using a trephine bar of an outer diameter of 6 mm and using saline to prevent excess heating, a bone defect of a diameter of 6 mm was formed on each parietal bone, next to the sagital midline. Depending on the group the procedure was followed by i) surgical wound suturing without any further treatment (group A as well as all the systematic administration groups) or ii) placing of a water for injection-conditioned collagen sponge membrane into the defects and wound suturing. In the respective groups and in order to examine the local effect of simvastatin, 0.1 ml of a solution of simvastatin 5 mg/ml in water for injection or in DMSO were applied on the membrane. Animals were sacrificed after 2, 4 or 8 weeks with respect to the protocol and the group and the specimens were appropriately for histo-morphometric study. Results (per subgroup) include: number of specimens (n), percentage % of new bone formation per specimen and mean and standard deviation of the percentage of new bone formation per group. Statistical analysis was performed with SPSS Software and Mann-Witney-U test for independent samples. In detail, statistical analysis referred to the comparison of the percentage % of bone healing with respect to study duration between: • Subgroups within each group, in order to assess the difference in percentage of bone healing between different study durations. • Subgroups of different groups (with respect to route of administration), in order to assess differences in bone healing percentage between specimens that came from groups of the same study duration. • Subgroups within different groups with the same route of administration and approximately. Comparative analysis of results demonstrated the following: 1. Normal large bone defect healing without any intervention (group A) develops more stably and periodically than all other groups, with statistically significant bone density increase between 2nd and 8th post-operative week. 2. The results of the group of bone healing with the use of a collagen membrane (Group B) indicate some positive effects of the membrane at 2 weeks post-operatively, that become significant at 4 weeks post-operatively, i.e. at the time when the membranes has been already absorbed 3. Diclofenac (DFS group) exerts a direct inhibitory effect on bone healing when systematically administered, in agreement with recent evidence that it exerts this role through decrease in BMP-7 also known as osteopontin 1 (OP-1), that is necessary for bone formation. 4. Intraperitoneal simvastatin injection (10 mg/kg BW daily, group STS), although initially led to the statistically significant increase in bone healing up to the 2nd week, provoked a statistically significant decrease in bone formation (STS1 vs STS2). This finding suggests a positive, followed by a negative effect of simvastatin on osteogenesis when administered systematically. This action is likely not direct but a secondary effect of severe myopathy that was observed in by means of histology. 5. Simvastatin, the most widely used statin, appears to have the ability to promote bone healing even in large bone defects and this is apparent when administered systematically and more precisely, in this study, intraperitoneal. 6. This promoting effect is ameliorated with the administration in a DMSO solution (STDS group), a solvent that seems to have the ability to promote the more efficient delivery and absorption of simvastatin, locally as well as systematically. 7. Besides, toxic effects of systematically administered simvastatin were observed, mainly myopathy that induced a severe fatigue to the animal. Myopathy was a main limiting factor for the survival of the animals after the 5th post-operative week and for the bone healing process. The latter can be postulated given that the initially promoting effect of simvastatin, observed by comparison of groups of study at 2 weeks post-operatively, later ceases to be observed for simvastatin administered in water for injection and in DMSO. 8. The explanation of the effects of simvastatin on bone healing seem to implicate the concept of its pleiotropic actions, i.e. the inhibition of mevalonic acid and activation of BMP-2, a major bone formation-promoting protein. 9. Local administration of 0.5 mg of simvastatin has a rather inhibitory effect on large bone defect healing but this seems to "turn for the best" when administered in a DMSO solution, an element to further clarify regarding dose and time of application, as well as the composition of the solution. 10. An impressive finding of this study is the observation of the process of bone defect healing between groups A (normal healing without intervention) and Β (collagen membrane application). Normal healing appeared more efficient with a stable increase in bone density in all time-points and significantly increased compared to this of group Β rats in 2 weeks post-operatively. The process of bone defect healing in these two groups seems to converge with no more observation of significant differences in bone density after 4 and 8 weeks post-operatively, i.e. when membrane has already started being absorbed.

Τα ΜΣΑΦ και οι στατίνες αποτελούν δύο ευρέως συνταγογραφούμενες ομάδες φαρμάκων που επηρεάζουν την οστική επούλωση και τον ανασχηματισμό του οστού άλλοτε ασκώντας αρνητική και άλλοτε θετική δράση. Τα επιστημονικά δεδομένα εξακολουθούν να παραμένουν συγκεχυμένα και ο σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να συμβάλλει προς αυτήν την κατεύθυνση, διερευνώντας την επίδραση της δικλοφενάκης και σιμβαστατίνης στην επούλωση προκλητών οστικών ελλειμμάτων. Ως ΜΣΑΦ επιλέχθηκε η δικλοφενάκη (Voltaren®: Novartis Hellas), η οποία χορηγήθηκε ενδομυϊκά σε ποσότητα 5mg/kg Β Σ ημερησίως για το αντίστοιχο χρονικό διάστημα. Ως στατίνη επιλέχθηκε η σιμβαστατίνη η οποία χορηγήθηκε συστηματικά και τοπικά. Η σιμβαστατίνη (Sigma-Aldrich, USA) διαλύθηκε σε ενέσιμο ύδωρ ή κατά 50% σε ενέσιμο ύδωρ και κατά 50% σε DMSO και χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκά σε ποσότητα 10mg/kg Β.Σ. ημερησίως για το αντίστοιχο χρονικό διάστημα μελέτης. Η τοπική εφαρμογή αφορούσε διάλυμα σιμβαστατίνης η οποία αραιώθηκε σε ενέσιμο ύδωρ ή σε διάλυμα DMSO και η χορηγηθείσα ποσότητα ορίστηκε στα 0.5mg ανά έλλειμμα. Ως πειραματόζωα χρησιμοποιήθηκαν 144 επίμυες τύπου wistar αρσενικού φύλλου και βάρους περίπου 350 gr. Σε κάθε πειραματόζωο δημιουργήθηκαν, προς ανάπτυξη του πρωτοκόλλου της έρευνας, δύο οστικά ελλείμματα αντιστοίχως των βρεγματικών οστών του κρανίου, με αποτέλεσμα το σύνολο των δειγμάτων που επεξεργάστηκε η έρευνα να ανέλθει στα 288. Από το σύνολο των δειγμάτων μελετήθηκαν ιστολογικά 195 δείγματα τα οποία κατανεμήθηκαν σε 7 κυρίες ομάδες, ανάλογα με το είδος της χορηγούμενης ουσίας, την οδό χορήγησης και του τρόπου επούλωσης του οστικού ελλείμματος (με ή χωρίς μεμβράνη), και 18 υποομάδες, ανάλογα με τον χρόνο ελέγχου που ήταν 2, 4 και 8 εβδομάδες. Η πειραματική μέθοδος που ακολουθήθηκε ήταν η παρακάτω: Με τη βοήθεια κοίλης φρέζας τύπου trephine bur εξωτερικής διαμέτρου 6 χιλ. και υπό καταιονισμό φυσιολογικού ορού δημιουργήθηκαν 2 οστικά ελλείμματα κυκλικού σχήματος και διαμέτρου 6mm στα βρεγματικά οστά του κρανίου εκατέρωθεν της μέσης οβελιαίας ραφής. Ανάλογα της ομάδας ελέγχου, ακολούθησε: είτε η επαναφορά και συρραφή του τραύματος χωρίς καμία άλλη παρέμβαση (ομάδα Α και όλες οι ομάδες που αφορούσαν στη συστηματική χορήγηση των υπό έλεγχο ουσιών, είτε η τοποθέτηση της κολλαγόνου σπογγώδους μεμβράνης, τύπου fleece, μετά από εμποτισμό της σε ενέσιμο ύδωρ και συρραφή του τραύματος. Στις αντίστοιχες κατά περίπτωση ομάδες, για τον έλεγχο της τοπικής δράσης της σιμβαστατίνης, η μεμβράνη εμποτίστηκε με 0.1 ml απλού διαλύματος σιμβαστατίνης ή 0,1 ml διαλύματος σιμβαστατίνης σε συνδυασμό με διάλυμα DMSO συγκέντρωσης 5mg/ml. Τα πειραματόζωα θυσιάστηκαν μετά από 2, 4 και 8 εβδομάδες ανάλογα με το πρωτόκολλο και την ομάδα ελέγχου και τα παρασκευάσματα προετοιμάστηκαν κατάλληλα για ιστομορφομετρική μελέτη. Καταγράφηκαν τα αποτελέσματα κάθε δείγματος σε συγκεκριμένο χρόνο ελέγχου. Τα αποτελέσματα περιελάμβαναν, ανά υποομάδα, τον αριθμό των δειγμάτων (η), το ποσοστό %, με στρογγυλοποίηση σε δεύτερο δεκαδικό, της οστικής πλήρωσης του ελλείμματος ανά δείγμα, καθώς και τον υπολογισμό της μέσης τιμής (x) με τη σταθερά απόκλισης (±sd) του ποσοστού οστικής πλήρωσης για κάθε υποομάδα. Ακολούθησε στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων με το στατιστικό λογισμικό SPSS και με τη μέθοδο Mann-Whitney-U test για ανεξάρτητα δείγματα. Η στατιστική επεξεργασία περιλάμβανε τη συγκριτική αξιολόγηση του % ποσοστού οστικής επούλωσης σε σχέση με το χρόνο ελέγχου μεταξύ: Ι. Των υποομάδων κάθε ομάδας, με στόχο τον έλεγχο της πορείας της οστικής επούλωσης σε διαφορετικούς χρόνους ελέγχου II. Των υποομάδων διαφορετικών ομάδων όσον αφορά στην οδό χορήγησης, με στόχο την παρατήρηση τυχόν διαφοροποιήσεων στην επουλωτική διαδικασία σε παρόμοιους χρόνους ελέγχου. III. Των υποομάδων διαφορετικών ομάδων με παρόμοια οδό χορήγησης και σε παρόμοιους χρόνους ελέγχου. Η επεξεργασία και η συγκριτική ανάλυση των αποτελεσμάτων κατέληξε στα παρακάτω συμπεράσματα: 1. Η φυσιολογική επούλωση ευμεγεθών οστικών ελλειμμάτων χωρίς παρεμβάσεις (ομάδα Α) αποδεικνύεται να αναπτύσσεται περισσότερο σταθερά και περιοδικά από όλες τις ομάδεςμελέτης, με σημαντικά στατιστικά αυξημένη οστική πυκνότητα μεταξύ 2ης και 8ης εβδομάδας. 2. Στην επεξεργασία των αποτελεσμάτων της ομάδας οστικής επούλωσης με τη χρήση μεμβράνης κολλαγόνου (ομάδα ελέγχου Β), διακρίνεται κάποιου μικρού βαθμού θετική συμβολή της μεμβράνης κολλαγόνου κατά τον έλεγχο των 2 εβδομάδων, η οποία αρχίζει να αυξάνεται σημαντικά μετά την 4η εβδομάδα, δηλαδή περίπου με την απορρόφησης της. 3. Η δικλοφενάκη (ομάδα DFS) αποδείχθηκε ότι δρα άμεσα ανασταλτικά στην οστική επουλωτική διαδικασία όταν χορηγείται συστηματικά, συμφωνώντας με νεότερες έρευνες, λόγω μείωσης της ΒΜΡ-7, γνωστής ως οστεοποντίνη (ΟΡ-1), ουσίας απαραίτητης για τον οστικό ανασχηματισμό. 4. Η ενδοπεριτοναϊκή έγχυση σιμβαστατίνης 10 mg/kg Β.Σ. ημερησίως (ομάδα STS), αρχικά έδειξε μία σαφώς θετική οστική επουλωτική δραστηριότητα που καταγράφηκε μέχρι τη 2η εβδομάδα και στη συνέχεια φαίνεται να μην προάγει την οστική ανάπλαση αλλά αντίθετα να προκαλεί στατιστικά σημαντική οστική απώλεια (STS1 vs STS2). Το εύρημα αυτό υποδηλώνει μια θετική και στη συνέχεια αρνητική για οστεογένεση δράση της σιμβαστατίνης όταν αυτή χορηγείται συστηματικά. Η δράση αυτή μπορεί να μην είναι άμεση, αλλά να θεωρηθεί έμμεση ως αποτέλεσμα, είτε της πρόκλησης έντονης μυοπάθειας που παρατηρήθηκε σε ιστολογικά παρασκευάσματα που ελέγχθηκαν σε δεύτερο χρόνο, είτε εξ' αιτίας ανάπτυξης φλεγμονής στην περιτοναϊκή χώρα όπου έλαβε χώρα η έγχυση του φαρμάκου. 5. Η σιμβαστατίνη ως η πλέον xχρησιμοποιούμενη σήμερα στατίνη, φαίνεται πως διαθέτει κάποιου βαθμού ενισχυτικές δυνατότητες στην εξέλιξη της οστικής επούλωσης ακόμη και σε ευμεγέθη προκλητά οστικά ελλείμματα. Η δυνατότητα της αυτή είναι εμφανής όταν χορηγείται συστηματικά, στη συγκεκριμένη περίπτωση ενδοπεριτοναϊκά. 6. Η ποιότητα της θετικής δράσης της σιμβαστατίνης βελτιώνεται με τη χρήση διαλύματος σιμβαστατίνης σε DMSO (ομάδα STDS), ενός διαλύτη ο οποίος φαίνεται να έχει την ικανότητα καλύτερης κατανομής και απορρόφησης της ουσίας τόσο τοπικά όσο κυρίως συστηματικά. 7. Ως παράπλευρη και ενδιαφέρουσα παρατήρηση ήταν η τοξικότητα που διαθέτει η σιμβαστατίνη όταν χορηγείται συστηματικά, με κυρίαρχη την ανάπτυξη μυοπάθειας που οδηγεί σε μεγάλη καταβολή του πειραματόζωου. Η εξέλιξη αυτή αποτέλεσε ισχυρή αιτία, αφ' ενός της αδυναμίας επιβίωσης των πειραματόζωων πέραν των 4 εβδομάδων, και αφ' ετέρου της μείωσης και αναστολής της οστεογενετικής διαδικασίας. Το τελευταίο, θα μπορούσε να ισχυριστεί κανείς, αποτελεί και την αιτία μείωσης της διαφαινόμενης αρχικά (έλεγχος 2ης εβδομάδας) θετικής δράσης της συστηματικής χορήγησης της σιμβαστατίνης τόσο απλού διαλύματος όσο και διαλύματος με DMSO. 8. Η ερμηνεία του φαινόμενου πιθανής θετικής δράσης της σιμβαστατίνης κλείνει περισσότερο προς την πλευρά των πλειοτροπικών δράσεων των στατινών ως αποτέλεσμα της αναστολής του μεβαλονικού οξέος με συνέπεια, να προάγεται η ενεργοποίηση της ΒΜΡ-2, κυρίαρχης πρωτεΐνης για τον οστικό ανασχηματισμό. 9. Η τοπική εφαρμογή 0,5 mg διαλύματος σιμβαστατίνης, έχει μάλλον ανασταλτική επίδραση στην οστική επούλωση ευμεγεθών οστικών ελλειμμάτων η οποία φαίνεται να διαφοροποιείται προς θετική κατεύθυνση με τη συμμετοχή του διαλύτη DMSO. Στοιχείο περαιτέρω έρευνας σε σχέση τόσο με τη δόση και το χρόνο εφαρμογής όσο και με τη σύσταση του διαλύματος. 10. Εντυπωσιακό εύρημα της παρούσας μελέτης αποτελεί και η παρατήρηση από τη σύγκριση της πορείας της επουλωτικής διαδικασίας των οστικών ελλειμμάτων μεταξύ των ομάδων Α (φυσιολογική επούλωση χωρίς παρεμβάσεις) και Β (επούλωση με εφαρμογή μεμβράνης κολλαγόνου). Η φυσιολογική χωρίς παρεμβάσεις οστική επούλωση αποδείχθηκε περισσότερο επιτυχής με σταθερή αύξηση της οστικής πυκνότητας σε όλους τους χρόνους ελέγχου και μάλιστα στατιστικά σημαντικότερη από αυτήν της ομάδας Β στον έλεγχο των 2 εβδομάδων. Η πορεία της οστικής επούλωσης και στις δύο ομάδες εξομαλύνεται χωρίς σημαντικές διαφορές στους ελέγχους των 4 και 8 εβδομάδων, δηλαδή μετά την έναρξη απορρόφησης της μεμβράνης κολλαγόνου.