Φασματοσκοπική μελέτη του μηχανισμού γένεσης της αθηρωματικής πλάκας

Abstract

Atherosclerosis is a multifuctorial disease with increased morbidity and mortality and its treatment is difficult. In this thesis, two method of analysis were used: FT-IR spectroscopy with ATR and SEM analysis. The FT-IR spectra showed that the onset of atheromatosis begins with lipid and membrane phospholipids peroxidation from free radicals, which are produced during metabolism or oxidative stress. From the characteristic band at 3082 cm-1 it is concluded that the foam cells are rich in LDL, while the band at 1736 cm-1 corresponds to the carboxyl group –C=O due to hyperoxidation of lipids through free radicals. These two bands could be used as diagnostic bands for LDL concentration. The IR bands in the region 1700-1500 cm-1 are assigned to the vibrations modes of amide I, amide II and amide III of proteins. From the shifting of these bands to shorter wavenumbers it was suggested that the proteins change their structure from α-helix to random coil due to fragmentation induced from free radical reactions. The absorption of the characteristic bands at 1454 cm-1 and 1370 cm-1 correspond to bending vibrations dCH2 and dCH3 of the lipids, respectively. The absorptions in the region 1300-1000 cm-1 matched the spectral patterns that arise from amide III and the asymmetric and symmetric stretching modes of PO2– in DNA or the phosphodiester groups of the phospholipids, cholesterol ester and –C-O-C- vibrations of fatty acids and ketals. In patients with high levels of sugar in their blood significant intensity increase was observed of the sugar band, due to a reduction of the hydrophobic environment, resulting from the breaking of lipids and proteins followed by changes in their structures. From SEM images of atheroma, appears that the effect of fission of lipids and phospholipids caused by free radicals is the formation of calcium salts from phosphate and carbonate groups of biological molecules. There were found heavy metals that were either associated with the disease or the working environment. The presence of Mo was associated with non-regulation of uric acid in the blood of the patient. These findings agree with the corresponding increase in disulfide seen both in the infrared spectra in the region 700-500 cm-1 and the detection of sulfur in SEM analyses. Finally, it appears that infrared spectroscopy could be used for the pre-diagnosis and treatment of the disease at a very early stage, thus reducing mortality.

Η αθηρωμάτωση αποτελεί μια νόσο με υψηλή νοσηρότητα και θνητότητα, με αποτέλεσμα η αντιμετώπισή της να είναι δυσχερής. Οι μέχρι σήμερα χρησιμοποιούμενες απεικονιστικές μέθοδοι παρέχουν μακροσκοπικές πληροφορίες χωρίς να μπορούν να δώσουν μεταβολές της χημικής σύστασης και μοριακής δομής των πρωτεϊνών. Στην παρούσα διατριβή χρησιμοποιήθηκαν η FT-IR φασματοσκοπία με ATR και η SEM ανάλυση. Από τα πειράματα διαπιστώθηκε ότι η έναρξη της αθηρωμάτωσης ξεκινά από την υπεροξείδωση των λιπιδίων και φωσφολιπιδίων των μεμβρανών από τις ελεύθερες ρίζες που παράγονται κατά το οξειδωτικό στρες. Οι πρώτες βλάβες φαίνεται να εμφανίζονται στην μεταβολή της μοριακής δομής των πρωτεϊνών από α-έλικα σε τυχαία δομή, όπως φαίνεται από την περιοχή των φασμάτων 1800-1500 cm-1. Αυξανομένης της οξείδωσης μεταβάλλεται το λιπόφιλο περιβάλλον των μεμβρανών, οδηγώντας στο συμπέρασμα ότι οι ελεύθερες ρίζες υδροξυλίου διασπούν τις αλειφατικές αλυσίδες των λιπιδίων και φωσφολιπιδίων. Τα υπέρυθρα φάσματα έδειξαν επίσης ότι οι περιοχές των αφρωδών κυττάρων είναι πλούσιες σε LDL, ενώ οι ταινίες στα 3080 και 1740 cm-1 θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως δείκτες υπεροξείδωσης και μέτρησης της LDL. Από τις SEM εικόνες των αθηρωμάτων φαίνεται ότι αποτέλεσμα της σχάσης των λιπιδίων και φωσφολιπιδίων είναι ο σχηματισμός αλάτων ασβεστίου από τις φωσφορικές και ανθρακικές ομάδες των βιολογικών μορίων. Επίσης οι SEM αναλύσεις των αθηρωμάτων έδειξαν την παρουσία μετάλλων τα οποία συνδέονται ή με την ασθένεια ή με το εργασιακό περιβάλλον των ασθενών. Τα μέταλλα αυτά έχει αποδειχθεί ότι προκαλούν οξειδωτικό στρες στον ανθρώπινο οργανισμό αιτιολογώντας τον σχηματισμό ελευθέρων ριζών. Η παρουσία μολυβδαινίου ήταν συνάρτηση της αύξησης και μη ρύθμισης του ουρικού οξέως των ασθενών, οδηγώντας στο συμπέρασμα ότι τα μολυβδοένζυμα των ασθενών δεν μπορούσαν να επαναφέρουν την ξανθίνη σε υποξανθίνη, αυξάνοντας έτσι τα επίπεδα του ουρικού οξέως στο αίμα. Τα ευρήματα αυτά συμφωνούν και με την αντίστοιχη αύξηση των δισουλφιδίων που παρατηρείται τόσο από τα φάσματα στην περιοχή 700-500 cm-1 όσο και από την ανίχνευση θείου στις αναλύσεις SEM. Δηλαδή ο οργανισμός προσπαθώντας να αντιμετωπίσει την υπεροξείδωση καταναλώνει τις ενδογενείς προστατευτικές θειόλες, προσφέροντας τα ευκίνητα άτομα υδρογόνου και παράγοντας ως τελικό προϊόν δισουλφίδια. Τέλος, φαίνεται ότι η υπέρυθρη φασματοσκοπία θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την προδιάγνωση της ασθένειας και την αντιμετώπισή της σε πρώιμο στάδιο, μειώνοντας έτσι την θνητότητα.