FT-IR μελέτη καρκίνων του μαστού και χημειο-ακτινοθεραπευτικό αποτέλεσμα

Abstract

Breast cancer is the most common malignancy in women around the world, particularly after menopause. Early and reliable detection of the disease, leads to cure, increased quality of life and survival rates. The diagnostic procedures used at the moment, give information on tumor location and size but are unable to explain the molecular damages on important biological molecules such as proteins, DNA, membrane’s components, induced by the disease. The present study has utilized the Infrared Spectroscopy in order to study the detected molecular changes, induced by breast cancer on cellular components such as collagen, proteins, membranes, DNA. For the study, 7 biopsies from lobular and 5 from ductal breast cancer, as well as 14 digital mammograms before and after treatment have been used. The FT-IR spectra analysis demonstrated that the damages in molecular level, induced by the disease, are generally related to the histological type of cancer and also to the tumor grade. It has been observed that higher tumor grade was related to significant attenuation of the νNHgroup stretching vibrations at wavelength of 3290 cm-1, for the proteins and the DNA. The decrease in the intensity demonstrates that there is protein disintegration in to newly formed products with moreNH terminal groups, as revealed by the shoulder band observed at 3450 cm-1. The appearance of a new band at the wavelength of 3080 cm-1 indicates that during the procedure of carcinogenesis one of the main stages is the oxidative stress and the hydroxyl free radicals produced, react with the lipids and phospholipids of the cellular membrane. The increased intensities of the absorbion bands of symmetric and asymmetric stretching vibrations of the methylene groups, vCH2 leads to the conclusion that cancer enhances not only the lipophilic environment but also the fibrosis procedure. It is important to highlight that the lipophilic environment inhibits the oxygen diffusion to cancer cells due to the absence of water leading to cellular radioresistance. Moreover, the reduction of the hydrophilic environment decreases the indirect effectiveness of irradiation to cancerous cells caused by hydroxyl free radicals and hydrated electrons produced after water radiolysis, the major constituent of the cell. The new band at the 1743 cm-1 is attributed to malonaldehyde formation and confirms the prevalence of oxidative stress in carcinogenesis. It is well known that malonaldehyde presence is correlated with disease evolution. The aldehyde formation in conjunction with the increased lipophilic environment, gives a satisfactory interpretation, regarding the oxygen absence at tumor location and consecutively the resistance of cancer cells to radiotherapy. The reduction and shifting of the vibration bands of amide I and amide II from 1650 cm-1 and 1550 cm-1,to lower wavelengths of 1645 cm-1 and 1540 cm-1, respectively, inthe case of grade I cancers, reveals that proteins lose their α-helix configuration and acquire a random coil structure. This random coil configuration of proteins increases the protein’s reactive surface leading to damage. The new absorption bands that appear at frequencies of 1690 cm-1 and 1561 cm-1 which, are attributed to antiparallel β-sheet (β-sheet ↑↓) and parallel β-sheet (β-sheet ↑↑), respectively, confirm the amyloid proteins formation and the dominance of lipophilic environment. In amyloid proteins, as a result of the fact that environment has been transformed in lipophilic, their terminal hydrophilic groups –NH and C=O, turn to the inner part of the protein chain. This reverse of the hydrophilic environment into lipophilic, we believe to be the cause of cancer cell resistance to chemotherapy and radiotherapy From the band at 825 cm-1,which is attributed to the native right hand helix of B- DNA, it was showed that from grade I tumors, where this configuration is dominant, passing to grade II tumors, there is coexistence of normal helix of B-DNA and right hand A-DNA. Whereas, in grade III tumors is proven that only the Z-DNA configuration exist, confirming that all the DNA’s sugar and phosphate groups came in to a zig-zag configuration. and right hand A-DNA. Whereas in grade III tumors is proven that only the Z-DNA configuration exist, confirming that all the DNA’s sugar and phosphate groups came in to a zig-zag configuration. Comparing the infrared spectra from patient’s tissues received radiotherapy, it was concluded that cells become more lipophilic and the band at 815 cm-1, which is attributed to Z-DNA increases too. This finding leads to the conclusion that irradiation contribute to the modification of normal B-DNA and thus to carcinogenesis. Chemotherapy shows to cause similar changes to radiotherapy. Additionally, the patient’s digital mammograms were analyzed by the software of imageanalysis (ImageJ). The analysis revealed presence of calcifications in mammographs of the patients in study and these findings were fully in accordance with the findings of their histopathologic analysis. Characteristic was also the irradiation effect on patient’s skin after radiotherapy. Skin ageing in these patients was featured via ImageJ software by analyzing photos of the same anatomic region of the same breast before and after radiation. The image analysis managed to reveal the rapture of the bound that holds together the collagen and acid hyaluronic chains in the skin, situation that is caused by the irradiation effect.

Ο καρκίνος του μαστού προσβάλλει μεγάλο αριθμό του γυναικείου πληθυσμού ιδιαίτερα μετά την εμμηνόπαυση. Η έγκαιρη και έγκυρη διάγνωση οδηγούν στην ίαση από την ασθένεια και αυξάνουν την ποιότητα και το προσδόκιμο ζωής των ασθενών. Οι μέχρι σήμερα διαγνωστικές μέθοδοι εντοπίζουν την θέση και το μέγεθος της βλάβης, αλλά δεν απαντούν στο ερώτημα για τις μοριακές βλάβες που προκαλεί η ασθένεια στα σημαντικά βιολογικά μόρια, όπως πρωτεΐνες, DNA, μεμβράνες. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε η υπέρυθρη φασματοσκοπία με μετασχηματισμό Fourier (Fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR) για την μελέτη των μοριακών μεταβολών που προκαλεί ο καρκίνος του μαστού στα συστατικά των κυττάρων,όπως κολλαγόνο, πρωτεΐνες, μεμβράνες, DNA. Για την μελέτη χρησιμοποιήθηκαν 7 βιοψίες λοβιακού και 5 πορογενούς καρκίνου του μαστού, καθώς και 14 μαστογραφίες ασθενών, πριν και μετά την θεραπεία.Τα FT-IR φάσματα έδειξαν ότι, γενικά οι βλάβες αποτελούν συνάρτηση του ιστολογικού τύπου του καρκίνου (λοβιακό, πορογενές, σάρκωμα), αλλά και τoν βαθμό κακοήθειας των καρκινικών κυττάρων (tumor grade). Παρατηρήθηκε ότι με την αύξηση του grade οι δονήσεις τάσης των νΝΗ ομάδων των πρωτεϊνών και του DNA, μειώνονται σημαντικά στα 3290 cm-1. Η μείωση των εντάσεων δείχνει ότι οι πρωτεΐνες διασπώνται και παράγονται νέα προϊόντα με περισσότερες τερματικές ΝΗ ομάδες, όπως προκύπτει από τον ώμο που σχηματίζεται στα 3450 cm-1.Η εμφάνιση της νέας ταινίας στα 3080 cm-1, η οποία αποδίδεται στην δόνηση τάσης της ομάδας ν=CH με ολεφινικό χαρακτήρα, βεβαιώνει ότι κατά την ανάπτυξη του καρκίνου ένα από τα στάδια της ασθένειας είναι το οξειδωτικό στρες και ότι οι παραγόμενες ελεύθερες ρίζες υδροξυλίου αντιδρούν με τα λιπίδια και φωσφολιπίδια των μεμβρανών των κυττάρων, παρέχοντας προϊόντα με ολεφινικό χαρακτήρα. Η αύξηση των εντάσεων των ταινιών απορρόφησης των αντισυμμετρικών και συμμετρικών δονήσεων τάσεων των μεθυλ ομάδων, νCH2, οδηγεί στο συμπέρασμα ότι ο καρκίνος αυξάνει τόσο το λιπόφιλο περιβάλλον όσο και την ίνωση. Είναι σημαντικό να τονισθεί ότι το λιπόφιλο περιβάλλον παρεμποδίζει την διάχυση του οξυγόνου προς τα καρκινικά κύτταρα, αφού μειώνεται το υδρόφιλο περιβάλλον, και έτσι έχει ως αποτέλεσμα την μείωση της ακτινοευαισθησίας των κυττάρων στην ακτινοβόληση. Επιπλέον,ημείωσητουυδρόφιλουπεριβάλλοντοςπαρεμποδίζειτην αποτελεσματικότητα της ακτινοθεραπείας μέσω της έμμεσης δράσης των ιοντιζουσών ακτινοβολιών, αφού δεν παράγονται ελεύθερες ρίζες υδροξυλίου και ηλεκτρόνια από την ραδιόλυση του νερού.Η εμφάνιση της νέας ταινίας στα 1743 cm-1, η οποία αποδίδεται στον σχηματισμό μαλοναλδεΰδης, επιβεβαιώνει ότι κατά την ανάπτυξη του καρκίνου επικρατεί οξειδωτικό στρες. Η μαλοναλδεΰδη είναι γνωστός καρκινικός δείκτης της πορείας και εξέλιξης του καρκίνου.Επίσης ο σχηματισμός αλδεϋδών σε συνδυασμό με την αύξηση του λιπόφιλου περιβάλλοντος ερμηνεύει ικανοποιητικά την απουσία οξυγόνου στην θέση του καρκινικού όγκου, καθώς και την αντίσταση των καρκινικών κυττάρων στην ακτινοθεραπεία.Η μείωση και μετατόπιση των εντάσεων των δονήσεων κάμψης των ομάδων των amideΙ και amideΙΙ από 1650cm-1 και 1550 cm-1 προς μικρότερες συχνότητες 1645 cm-1 και 1540 cm-1, αντίστοιχα, σε καρκίνους με grade I δείχνει ότι οι πρωτεΐνες χάνουν την διαμόρφωση της α-έλικας και αποκτούν σε έδαφος καρκίνου grade I, δομή με έλικα τυχαίας περιέλιξης. Η τυχαία δομή καθιστά περισσότερο ευάλωτες τις πρωτεΐνες, αφού αυξάνει την δραστική επιφάνεια των πρωτεϊνών στην δράση των ελευθέρων ριζών.Οι νέες ταινίες απορρόφησης που εμφανίζονται στις συχνότητες 1690 cm-1 και 1516 cm-1, και οι οποίες αποδίδονται σε β-αντιπαράλληλα επίπεδα (β-sheet↑↓) και β- παράλληλα επίπεδα (β-sheet↑↑), αντίστοιχα, επιβεβαιώνουν τον σχηματισμό αμυλοειδών πρωτεϊνών και την επικράτηση του λιπόφιλου περιβάλλοντος. Στις αμυλοειδείς πρωτεΐνες, οι τερματικές υδρόφιλες ομάδες ΝΗ και C=O, επειδή το περιβάλλον έχει μετατραπεί σε λιπόφιλο, στρέφονται προς το εσωτερικό της αλυσίδας. Στην αναστροφή αυτή αποδίδουμε την αντίσταση των καρκίνων κυττάρων στην χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία. Από την ταινία στα 825 cm-1, η οποία αποδίδεται στην φυσιολογική δεξιόστροφη έλικα του B-DNA φάνηκε ότι μετά το grade Ι, όπου επικρατεί ακόμη η φυσιολογική δεξιόστροφη διαμόρφωση του B-DNA, περνώντας σε grade ΙΙ καρκίνους, συνυπάρχουν τόσο η διαμόρφωση του φυσιολογικού B-DNA όσο και η δομή του δεξιόστροφου Α- DNA. Σε grade ΙΙΙ νόσο διαπιστώθηκε ότι επικρατεί μόνο η διαμόρφωση Ζ-DNA, επιβεβαιώνοντας ότι οι φωσφοσακχαρούχες ομάδες του DNA απέκτησαν την zig-zag διαμόρφωση. Συγκρίνοντας τα υπέρυθρα φάσματα ιστών από ασθενείς που δέχθηκαν ακτινοβολία διαπιστώθηκε ότι υπάρχει αύξηση της λιποφιλικότητας των κυττάρων καθώς επίσης αυξάνει η ταινία στα 815 cm-1 που αποδίδεται στο Ζ-DNA. Το εύρημα αυτό οδηγεί στο συμπέρασμα ότι η ακτινοβολία συμβάλλει στην τροποποίηση του φυσιολογικού Β- DNA και επομένως στην καρκινογένεση. Η χημειοθεραπεία φαίνεται να προκαλεί αντίστοιχες μεταβολές με αυτές της ακτινοθεραπείας.Επιπλέον, οι μαστογραφίες αναλύθηκαν με τη βοήθεια του υπολογιστικού προγράμματος ανάλυσης εικόνας ImageJ. Η αποτύπωση μέσω της ανάλυσης εικόνας, της παρουσίας αποτιτανώσεων στις μαστογραφίες των υπό μελέτη ασθενών, βρίσκεται σε απόλυτη συμφωνία με τις ιστοπαθολογικές αναλύσεις τους. Χαρακτηριστική ήταν επίσης και η αποτύπωση της επίδρασης της ακτινοβολίας στο δέρμα των ασθενών που ακτινοβολήθηκαν. Σύγκριση της ImageJ ανάλυσης των εικόνων του δέρματος της ίδιας ανατομικής περιοχής του μαστού πριν και μετά την ακτινοβόληση των ασθενών, βεβαίωσε την γήρανση του δέρματος αυτής της περιοχής, όπως προέκυψε από την σχάση των δεσμών του υαλουρονικού οξέος που συγκρατούν τις αλυσίδες του κολλαγόνου.