Εργαστηριακή διερεύνηση της αστάθειας του δορυφορικού DNA, της μεθυλίωσης και των γονιδίων στόχων, ως δείκτες νεοπλασιών στον καρκίνο του παχέος εντέρου

Abstract

Colorectal cancer develops as the result of a stepwise progression through several genetic and epigenetic alterations. Aberrant DNA methylation of CpG islands and subsequent low- or high-level DNA microsatellite instability is assumed to drive colon carcinogenesis through frameshift mutations in target genes implicated in the regulation of cell growth or cell survival. The aim of this study was the search of the “molecular signature” which accompanies the transformation of a normal tissue first to a polyp and then to an adenoma and cancer using as molecular markers the microsatellite instability phenotype, promoter DNA methylation and the mutations of certain target genes. DNA extracted from blood, normal tissue, and tissues from polyps, adenomas and colorectal cancer of patients undergoing colonoscopy (healthy individuals, polyp/adenoma patients and colorectal carcinoma patients) was used to assess the microsatellite instability (using the five Bethesda markers), the prevalence of aberrant DNA methylation of hMLH1, P16 and MGMT promoter, and the frameshift mutations of target genes (ΒΑΧ, IGFIIR, hMSH3, hMSH6, TGFβRII, EGFR and c-MYB). Moreover, a total genomic sequence analysis of the MMR genes hMLH1 and hMSH2 was performed in all MSI-Η phenotype patients. Microsatellite instability was found in 17% of all of our patients, and particularly in those with tubulovillous/villous polyps or cancer. hMLH1 or CDKN2A/p16 promoter methylation was present only in tissue samples in contrast to MGMT that was also found in the blood. The frequency of promoter methylation for each locus grows up in the polyp/adenoma/carcinoma sequence with MGMT showing the higher frequency in each group. All colorectal cancer patients showed promoter DNA methylation in at least one locus, suggesting a potentially crucial role of DNA methylation in the progression of colorectal cancer. TGFβRII and c-MYB genes were mutated in all patients showing the MSI-Η phenotype together with simultaneous promoter DNA methylation of the three genes. One known mutation and one new mutation were found at the MSH2 gene in 2 of our MSI-Η patients (1 patient with HNPCC syndrome and one other with villous adenoma). DNA methylation analysis of a panel of genes provided specific methylation profiles for adenomatous/tubular polyps, tubulovillous/villous polyps and colorectal cancer, supporting the use of these alterations as a possible early detection marker. Moreover, the MSI phenotype resulted in promoter DNA methylation of hMLH1 and MGMT driving colorectal carcinogenesis through frameshift mutations not only in coding but possibly also in intronic repetitive sequences showing regulatory function, as for example EGFR and c-MYB. Finally, the overall examination of the genetic and epigenetic background, together with the detection of the pathological mutation at hMSH2 gene, may give for our patients the possibility of a better chemotherapeutic prevention and possibly a useful prognostic marker.

Ο καρκίνος του παχέος εντέρου εξελίσσεται ως το αποτέλεσμα μιας πορείας βημάτων σημαντικών γενετικών και επιγενετικών αλλαγών. Η ασυνήθης μεθυλίωση στις νησίδες CpG ακολουθούμενη από χαμηλού ή υψηλού επίπεδου αστάθεια του μικροδορυφορικού DNA, θα οδηγήσουν στην καρκινογένεση του παχέος εντέρου μέσω μεταλλάξεων μετατόπισης πλαισίου σε γονίδια στόχους τα οποία εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου ή της κυτταρικής επιβίωσης. Στόχος της παρούσας μελέτης ήταν η αναζήτησης της «μοριακής υπογραφής» που συνοδεύει την εξαλλαγή ενός φυσιολογικού ιστού αρχικά σε πολύποδα και αργότερα σε προχωρημένο πολύποδα και καρκίνωμα, χρησιμοποιώντας ως δείκτες την μικροδορυφορική αστάθεια την μεθυλίωση των υποκινητών κάποιων γονιδίων και τις μεταλλάξεις των γονιδίων στόχων. Το DNA που απομονώθηκε από αίμα, φυσιολογικό ιστό καθώς και ιστό από πολύποδες και καρκίνο, των ασθενών της μελέτης μας (υγιή άτομα, ασθενείς με πολύποδες και/ή καρκίνο), οι οποίοι υποβλήθηκαν σε κολονοσκόπηση, χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η μικροδορυφορική αστάθεια (με την χρήση των 5 δεικτών Bethesda), η ασυνήθης μεθυλίωση στους υποκινητές των γονίδιων hMLHl PI6 και MGMT καθώς και οι μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου σε γονίδια στόχους (TGFβRII, ΒΑΧ, IGFIIR, hMSH3, hMSH6, EGFR και c-ΜΥΒ). Τέλος με τη χρήση της πλήρης αλληλούχισης έγινε έλεγχος για μεταλλάξεις στα γονίδια του συστήματος MMR, τα hMLH1 και hMSH2, σε όλους τους ασθενείς με τον φαινότυπο MSI-H. Η μικροδορυφορική αστάθεια εμφανίστηκε σε ποσοστό 17% του συνολικού αριθμού των ασθενών που μελετήθηκαν και συγκεκριμένα μόνο στους ασθενείς με σωληνολαχνωτούς/λαχνωτούς πολύποδες και καρκίνο του παχέος εντέρου, ενώ η μεθυλίωση στους υποκινητές των γονιδίων hMLH1 και P16 παρατηρήθηκε μόνο στο δείγμα του παθολογικού ιστού των ασθενών, σε αντίθεση με τον υποκινητή του γονιδίου MGMT, ο οποίος εμφάνισε μεθυλίωση και σε 21 δείγματα DNA από αίμα. Επιπλέον η συχνότητα εμφάνισης της μεθυλίωσης σε κάθε γονίδιο αυξάνεται καθ’ όλη την πορεία πολύποδας/αδένωμα/καρκίνος με το γονίδιο MGMT να εμφανίζει τα υψηλότερα ποσοστά μεθυλίωσης σε κάθε ομάδα ασθενών. Το γεγονός ότι όλοι οι ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου εμφάνισαν μεθυλίωση σε τουλάχιστον ένα από τα εξεταζόμενα γονίδια, υποδεικνύει τον σημαντικό ρόλο της μεθυλίωσης στην πορεία εξέλιξης του καρκίνου του παχέος εντέρου. Επίσης, τα γονίδια TGFβRII και c-MYB ήταν μεταλλαγμένα σε όλους τους ασθενείς με τον φαινότυπο MSI-Η και με επιπλέον μεθυλίωση στους υποκινητές και των τριών γονιδίων. Τέλος βρέθηκαν μια ήδη γνωστή και μια νέα μετάλλαξη στο γονίδιο hMSH2 σε 2 ασθενείς με τον φαινότυπο MSI-Η (ο ένας ασθενής με το σύνδρομο HNPCC και ο άλλος με λαχνωτό πολύποδα). Ο έλεγχος της μεθυλίωσης των υποκινητών των γονίδιων για τις τρεις διαφορετικές ομάδες ασθενών με αδενωματώδεις/σωληνοειδής πολύποδες, σωληνολαχνωτούς/λαχνωτούς πολύποδες και καρκίνο του παχέος εντέρου, παρείχε ειδικές πληροφορίες για το μεθυλιωμένο προφίλ της κάθε ομάδας, υποστηρίζοντας έτσι τη χρήση της ως ένας πρώιμος δείκτης ελέγχου. Επιπλέον ο φαινότυπος MSI, ως αποτέλεσμα μεθυλίωσης στους υποκινητές των γονίδιων hMLH1, P16 και MGMT οδηγεί στην καρκινογένεση του παχέος εντέρου μέσω μεταλλάξεων όχι μόνο σε κωδικοποιούσες περιοχές αλλά πιθανόν και σε περιοχές ιντρονίων με επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες ρυθμιστικής αξίας για τα γονίδια, όπως στα γονίδια EGFR και c-ΜΥΒ Τέλος ο πλήρης έλεγχος του γενετικού και επιγενετικού υπόβαθρου και επιπλέον η ανακάλυψη των παθογόνων μεταλλάξεων στο γονίδιο hMSH2 θα ωφελήσει κάθε ασθενή ξεχωριστά για μια πιο στοχευμένη χημειοθεραπευτική προσέγγιση καθώς και τις οικογένειες τους ως ένας πιθανός προγνωστικός δείκτης.