Διερεύνηση μοριακών προγνωστικών παραγόντων στον καρκίνο του παχέος εντέρου

Abstract

Introduction: Colorectal cancer is a major cause of cancer-related morbidity and mortality in the western world and has a significant impact on the health care systems. The deep understanding of molecular mechanisms that underline cellular transformation and tumor progression leads to the identification of key-molecules that are appropriate targets for sophisticated therapy in cancer. One such targeted approach exploits the presence of specific biomarkers that could be considered essential for tumor development. The role of such a biomarker, Human Εpidermal Receptor-1 (ΗΕR-1/EGFR), has been established in the development of colorectal cancer, suggesting the potential involvement of neighboring receptors, such as Human Εpidermal Receptor-3 (HER-3). HER-3 is a membranic receptor implicated in intracellular cell proliferation signaling. Thus, quantitative modifications in its expression and/or qualitative changes in its structure may contribute to cellular malignant transformation. The significance of HER3 expression, localization and phosphorylation remains elusive and data regarding its role in the pathogenesis, diagnosis, prognosis and management of colorectal cancer is limited. Apart from their mebranic counterparts, nuclear receptors are implicated in the regulation of gene transcription. Estrogen receptors (ER) α and β mediate the estrogen actions in the subcellular microenvironment. Differences in the incidence of colorectal cancer in the two genders have underlined the significance of ER expression in colorectal carcinogenesis. The specificity of estrogen activities in various cell types is mediated by the presence of tissue-specific coregulators (coactivators/corepressors). These proteins are specific transcription factors that bind to nuclear receptors, orchestrating their actions on the genome. Frequently, such coregulators are located in the cytoplasm, regulating the non genomic activity of the estrogens. Proline-, glutamic acid-, and leucine-rich protein 1 (PELP1), also known as modulator of non-genomic activity of ER (MNAR), amplified in breast cancer-1 (AIB1) and transcriptional intermediary factor-2 (TIF2) are considered major ER-coregulators. Thus, the investigation of their expression is inherent to the evaluation of estrogen-mediated mechanisms. The dynamic cross-talk between HER- and ER-driven signaling pathways has been described. The aim of this study is the investigation of the role of HER3, ER and coregulators PELP1/MNAR, AIB-1, TIF-2 (over)expression in the pathogenesis and prognosis of colorectal cancer. Material and Methods: Sections from formalin-fixed, paraffin-embedded colorectal tissue blocks, derived from 140 patients with colorectal cancer, were used. HER-3 mRNA levels of expression were assessed by quantitative RT-PCR in 54 colorectal adenocarcinomas and 29 normal mucosa specimens. The expression levels of both phosphorylated and unphosphorylated HER-3 protein were assessed by immunohistochemistry in 110 normal mucosa specimens, 24 adenomas and 140 adenocarcinomas. The expression levels of ER α and β, PELP1/ΜΝΑR were assessed by immunohistochemistry in 88 normal mucosa specimens, 30 adenomas and 113 adenocarcinomas. Additionally, the expression levels of ΑΙΒ1 and TIF-2 protein were assessed by immunohistochemistry in 83 normal mucosa specimens, 30 adenomas and 110 adenocarcinomas. Results: HER-3 was detected both in the cytoplasm and nucleus, whereas pHER-3 was observed in the nucleus and membrane of cells. A possible switch in HER-3 topography from the nucleus to the cytoplasm during colorectal tumorigenesis is suggested. The expression of pHER-3 did not differ significantly in normal tissue, adenomas and carcinomas, but was related to disease stage. HER-3 mRNA overexpression was significantly associated with decreased time to disease progression. It was also correlated with higher median age, left colon and rectal tumour sites and lymph node involvement. ERα expression was extremely rare in colorectal tissue of our cohort and its expression did not appear to be associated with colorectal carcinogenesis. ERβ and PELP1/MNAR were detected in the nucleus of epithelial, endothelial, inflammatory, smooth muscle cells and myofibroblasts. When intensity of staining was taken into account, the expression of both proteins was significantly increased in epithelial cells of carcinomas compared to normal mucosa. ERβ expression in epithelial cells was correlated with decreased disease progression-free survival. PELP1/MNAR overexpression in epithelial cells was found to be an independent favorable prognostic factor. AIB1 and TIF2 were detected in the nucleus of epithelial, endothelial, inflammatory, smooth muscle cells and myofibroblasts. The expression of both proteins was significantly increased in epithelial cells of carcinomas compared to normal mucosa. In carcinomas, a significant correlation between the levels of expression of AIB1 and TIF2 was noted, but there was no correlation between the expression patterns of these two proteins and ERβ. Although AIB1 overexpression was associated with local tumor invasion, it was also found to correlate independently with prolonged overall survival. TIF2 overxpression did not appear to correlate with clinicopathological parameters. Conclusion/Discussion: This study highlights the significance of ΗΕR3 expression and phosphorylation in colorectal carcinogenesis, supporting also its potential prognostic significance. This study supports literature data regarding HER3 expression in colorectal tissue, while is the first to imply a possible prognostic significance of HER-3 mRNA expression levels and to suggest a topographic switch of HER3 protein during colorectal carcinogenesis. ERβ1 protein levels were found to increase during colorectal carcinogenesis, a finding which corresponds only to a small portion of literature data. The prognostic role of nuclear receptors depends on a number of factors, such as coregulator expression levels, chemical modifications, subcellular localization and ligand/hormone levels. The concomitant increase in the expression levels of coregulators PELP1/MNAR, ΑΙΒ1 and ΤΙF2 during colorectal carcinogenesis might imply their potential participation in estrogen-mediated signaling. However, the characteristic absence of strong correlation between their expression pattern and ERβ1 expression pattern underlines their pluripotent role and their possible contribution to estrogen-independent signaling. Further studies with a large number of patients, appropriately designed and conducted using sensitive experimental and statistical methods, are required for the confirmation of our hypothesis generation results. In the post-genomic era, identification of useful molecular biomarkers might contribute to the improvement of the management and prognosis of patients with colorectal cancer.

Εισαγωγή-Σκοπός: Ο καρκίνος του παχέος εντέρου αποτελεί ένα από τα συχνότερα κακοήθη νεοπλάσματα παγκοσμίως, προκαλώντας σημαντική νοσηρότητα και θνητότητα. Η συστηματική διερεύνηση της παθογένειας συντελεί σημαντικά στην πρόληψη, έγκαιρη διάγνωση, θεραπεία και πρόγνωση της νόσου. Στην εποχή της μοριακής ιατρικής, η κατανόηση των μοριακών μηχανισμών καρκινογένεσης έχει αναδείξει το ρόλο ενδοκυττάριων σηματοδοτικών μονοπατιών, τα οποία ρυθμίζουν κυτταρικές διαδικασίες, όπως πολλαπλασιασμός, διαφοροποίηση, απόπτωση, αγγειογένεση, διήθηση. Κομβικά συστατικά τέτοιων μοριακών δικτύων αποτελούν οι υποδοχείς αυξητικών παραγόντων, όπως ο Human Εpidermal Receptor-1 (ΗΕR-1/EGFR), ο ρόλος του οποίου έχει τεκμηριωθεί στο αδενοκαρκίνωμα παχέος εντέρου, επιτείνοντας το ενδιαφέρον στη διευκρίνηση του ρόλου γειτονικών υποδοχέων, όπως του Human Εpidermal Receptor-3 (HER-3). O HER-3 συνιστά μεμβρανικό υποδοχέα που συμμετέχει σε μοριακά μονοπάτια ενδοκυτταρικής σηματοδότησης. Επομένως, ποσοτικές μεταβολές στην έκφρασή του αλλά και ποιοτικές αλλαγές στη δομή του, συντελούν δυνητικά στην κυτταρική εξαλλαγή. Τα δεδομένα από τη μελέτη του HER-3 στο αδενοκαρκίνωμα παχέος εντέρου είναι περιορισμένα και ο ρόλος του στην παθογένεια, πρόγνωση και θεραπεία της νόσου παραμένει ασαφής. Αντίστοιχα με τους μεμβρανικούς υποδοχείς, πυρηνικοί υποδοχείς ενέχονται σε διαδικασίες ρύθμισης γονιδιακής έκφρασης. Οι οιστρογονικοί υποδοχείς (ER) α και β διαμεσολαβούν την επίδραση των οιστρογόνων σε κυτταρικό επίπεδο, μεταποιώντας τα επίπεδα των ορμονών σε μεταβολές γονιδιακής έκφρασης. Οι διαφορές στην επίπτωση του καρκίνου του παχέος εντέρου ανάμεσα στα δύο φύλα καθώς και πρόσφατα βιβλιογραφικά δεδομένα έχουν αναδείξει τη σημασία της έκφρασης αυτών των υποδοχέων στην καρκινογένεση του παχέος έντερου. Παράλληλα, η εξειδίκευση της οιστρογονικής δράσης σε επίπεδο ιστού και κυττάρου εξασφαλίζεται μέσω της δράσης συγκεκριμένων συμπαραγόντων (ενεργοποιητών/καταστολέων). Αυτές οι πρωτεΐνες είναι ειδικοί μεταγραφικοί παράγοντες, οι οποίοι συνδεόμενοι με τους οιστρογονικούς αλλά και άλλους υποδοχείς «εξατομικεύουν» την ορμονική επίδραση στο γονιδίωμα. Ο proline-, glutamic acid-, and leucine-rich protein 1 (PELP1), γνωστός και ως modulator of non-genomic activity of ER (MNAR), ο amplified in breast cancer-1 (AIB1) και ο transcriptional intermediary factor-2 (TIF2) είναι σημαντικοί συμπαράγοντες οιστρογονικών υποδοχέων, με συνέπεια η μελέτη τους να αποτελεί αναπόσπαστο μέρος της διερεύνησης οιστρογονο-εξαρτώμενων μηχανισμών. Η συνεχής αλληλεπίδραση HER- και ER-εξαρτώμενων μονοπατιών έχει περιγραφεί σε ποικίλλους ιστούς. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση του ρόλου της (υπερ)έκφρασης του μεμβρανικού υποδοχέα HER-3, των οιστρογονικών υποδοχέων (ER) και των συμπαραγόντων PELP1/MNAR, AIB-1 και TIF-2 στον καρκίνο του παχέος εντέρου. Υλικά και μέθοδοι: Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν ιστικά δείγματα, μονιμοποιημένα σε φορμόλη και εκλεισμένα σε παραφίνη από 140 ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα παχέος εντέρου. Η έκφραση των επιπέδων HER-3 mRNA εκτιμήθηκε με τη μέθοδο της ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (RT-PCR) σε 54 αδενοκαρκινώματα και 29 δείγματα φυσιολογικού βλεννογόνου. Η έκφραση των επιπέδων της φωσφορυλιωμένης (pHER-3) και μη φωσφορυλιωμένης HER-3 πρωτείνης εκτιμήθηκε με τη μέθοδο της ανοσοιστοχημείας σε 110 δείγματα φυσιολογικού βλεννογόνου, 24 αδενώματα και 140 αδενοκαρκινώματα. Η έκφραση των επιπέδων του οιστρογονικού υποδοχέα α και β και του PELP1/ΜΝΑR εκτιμήθηκε με τη μέθοδο της ανοσοιστοχημείας σε 113 αδενοκαρκινώματα, 30 αδενώματα και 88 δείγματα φυσιολογικού βλεννογόνου. Αντίστοιχα η έκφραση των επιπέδων του ΑΙΒ1 και TIF-2 εκτιμήθηκε με τη μέθοδο της ανοσοιστοχημείας σε 110 αδενοκαρκινώματα, 30 αδενώματα και 83 δείγματα φυσιολογικού βλεννογόνου. Αποτελέσματα: Η πρωτεΐνη HER-3 εκφράζεται στο κυτταρόπλασμα και στον πυρήνα επιθηλιακών κυττάρων παχέος εντέρου σε φυσιολογικό βλεννογόνο, αδενώματα και αδενοκαρκινώματα και φαίνεται να μεταβάλλεται τοπογραφικά (από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα) κατά τη διαδικασία της καρκινογένεσης. Ωστόσο, η έκφραση της πρωτεΐνης HER-3 σε αδενοκαρκινώματα δε φαίνεται να συσχετίζεται σημαντικά με τις κλινικοπαθολογικές παραμέτρους της νόσου. Η φωσφορυλιωμένη μορφή της πρωτεΐνης HER-3 (pHER-3) εκφράζεται στον πυρήνα και τη μεμβράνη επιθηλιακών και λείων μυικών κυττάρων παχέος εντέρου σε φυσιολογικό βλεννογόνο, αδενώματα και αδενοκαρκινώματα. Η πυρηνική έκφραση pHER-3 δε διαφέρει σημαντικά ανάμεσα σε φυσιολογικό βλεννογόνο, αδενώματα και αδενοκαρκινώματα. Ωστόσο, αυξημένα επίπεδα πυρηνικής έκφρασης pHER-3 συσχετίζονται σημαντικά με μεγαλύτερο στάδιο της νόσου, χωρίς να συσχετίζονται με τα επίπεδα έκφρασης της μη φωσφορυλιωμένης μορφής. Τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου ΗER-3 δε φαίνεται να αυξάνουν σημαντικά κατά την καρκινογένεση. Ωστόσο, αυξημένα επίπεδα HER-3 mRNA στα αδενοκαρκινώματα σχετίζονται με μεγαλύτερη ηλικία των ασθενών, εντόπιση του όγκου στο αριστερό κόλον και το ορθό και με λεμφαδενική διήθηση. Επίσης, συχετίστηκαν με αυξημένη πιθανότητα υποτροπής της νόσου και μειωμένο χρονικό διάστημα ως την υποτροπή. Ο ERα εκφράζεται σπάνια στο παχύ έντερο σε αντίθεση με τον ERβ, ο οποίος εκφράζεται συχνά στον πυρήνα επιθηλιακών αλλά και στρωματικών κυττάρων. Η έκφραση της πρωτεΐνης ERβ καθίσταται πιο έντονη κατά τη διάρκεια της καρκινογένεσης σε άνδρες, και στα αδενοκαρκινώματα συσχετίζεται με την πιθανότητα υποτροπής της νόσου. Ο συμπαράγοντας PELP1/MNAR ανιχνεύεται στον πυρήνα επιθηλιακών αλλά και στρωματικών κυττάρων του παχέος εντέρου και η έκφρασή του αυξάνει κατά την καρκινογένεση και στα αδενοκαρκινώματα συσχετίζεται με την έκφραση του ERβ. Ωστόσο, η υπερέκφραση του PELP1/MNAR στα ERβ θετικά αδενοκαρκινώματα συσχετίζεται με μεγαλύτερη συνολική επιβίωση των ασθενών. Ο AIB1 και ο TIF2 ανιχνεύονται στον πυρήνα επιθηλιακών αλλά και στρωματικών κυττάρων του παχέος εντέρου. Η έκφραση του ΑΙΒ1 αυξάνει κατά την καρκινογένεση και συσχετίζεται με τοπική ανάπτυξη του όγκου. Ωστόσο, στην πολυπαραγοντική ανάλυση ο ΑΙΒ1 αναδεικνύεται ως ανεξάρτητος ευνοϊκός προγνωστικός παράγοντας ως προς τη συνολική επιβίωση. Η έκφραση του ΤΙF2 αυξάνει κατά την καρκινογένεση και στα αδενοκαρκινώματα συσχετίζεται με την έκφραση του AIB1. Ωστόσο, η έκφρασή του στα αδενοκαρκινώματα δε σχετίζεται με κλινικοπαθολογικές παραμέτρους της νόσου. Το πρότυπο έκφρασης των συμπαραγόντων AIB1 και TIF2 δε σχετίζεται σημαντικά με εκείνο του ERβ. Συζήτηση-συμπεράσματα-προοπτικές: Η παρούσα μελέτη αναδεικνύει τη σημασία της έκφρασης και φωσφορυλίωσης του ΗΕR3 στην καρκινογένεση του παχέος εντέρου, υποστηρίζοντας τον πιθανό ρόλο τους στην πρόγνωση της νόσου. Τα ευρήματα της μελέτης συμφωνούν με συγκεκριμένα βιβλιογραφικά δεδομένα ως προς τη συχνότητα ανίχνευσης του υποδοχέα στον παχύ έντερο, ενώ είναι η πρώτη η οποία αναδεικνύει τα επίπεδα HER-3 mRNA ως πιθανό προγνωστικό βιοδείκτη. Η διερεύνηση της έκφρασης του οιστρογονικού υποδοχέα β (ERβ1) ανέδειξε αύξηση των επιπέδων του κατά την καρκινογένεση, εύρημα που βρίσκεται σε συμφωνία με μερικά και σε αντιδιαστολή με άλλα βιβλιογραφικά δεδομένα. Η προγνωστική σημασία της έκφρασης των πυρηνικών υποδοχέων εξαρτάται από ποικίλους παράγοντες, όπως τα επίπεδα ειδικών συμπαραγόντων, ομοιοπολικές τροποποιήσεις, την τοπογραφία τους μέσα στο κύτταρο και τα επίπεδα συγκεκριμένων συγκεντρώσεων προσδέτη/ορμόνης. Η αύξηση των επιπέδων των συμπαραγόντων του οιστρογονικού υποδοχέα PELP1/MNAR, ΑΙΒ1 και ΤΙF2 κατά την καρκινογένεση υποδηλώνει πιθανή συμμετοχή τους σε οιστρογονοεξαρτώμενη ογκογόνο σηματοδότηση. Ωστόσο, η απουσία ισχυρής συσχέτισης ανάμεσα στα επίπεδα έκφρασής τους και στα επίπεδα έκφρασης του οιστρογονικού υποδοχέα (ERβ1) υπογραμμίζει την πλειοτροπική τους δράση και τον επιπρόσθετο ρόλο τους σε οιστρογονο-ανεξάρτητη ενδοκυττάρια σηματοδότηση. Περισσότερες μελέτες σε μεγάλο αριθμό ασθενών, κατάλληλα σχεδιασμένες και εκτελεσμένες, με τη χρήση ευαίσθητων και ειδικών πειραματικών τεχνικών καθώς και μεθόδων στατιστικής ανάλυσης απαιτούνται για την επιβεβαίωση των ευρημάτων της παρούσας μελέτης. Στην εποχή της μεταγονιδιωματικής ιατρικής, η αναζήτηση χρήσιμων μοριακών βιοδεικτών δύναται να συντελέσει στη βελτίωση της πρόγνωσης και της ποιότητας ζωής των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου.