Μελέτη της έκφρασης των γονιδίων των κυττάρων του ανθρώπινου περιόστεου: κλινικές εφαρμογές

Abstract

INTRODUCTION: Periosteum is a specialized connective tissue that surrounds the majority of human bones, supports the bone and ensures a constant supply of new osteoblasts to bone growth, repair and homeostasis. The presence of pluripotent mesenchymal cells, osteoprogenetor cells and growth factors within periosteum, makes it a very important tissue in the regenerative process of bone. Bone morphogenetic proteins (BMPs), which are established in periosteum, play a critical role among the growth factors in bone growth, remodeling and healing process. MATERIAL-METHODS: In the present thesis, human periosteal BMPs were analyzed and particularly the gene expression of BMP-2, BMP-4, BMP-6 and BMP-7, in a total of 314 periosteal samples, collected from patients of the Department of Orthopaedic Surgery of the University of Thessalia in Larissa, Greece, undergoing reconstructive skeletal procedures or open reduction and fixation of extremity fractures. The samples were categorized into normal samples (n = 107), fractured samples (n = 207), obtained from the site of fracture (n=193) or from a distance (n=14). Samples were further classified in groups of children and adults, while potential factors that might affect the expression of tested genes were studied and analyzed, depending on patient characteristics (age, gender, smoking, body mass index) and sample characteristics (area of origin - mechanical loading, size of donor bone). RNA was isolated, molecular biology techniques were performed in order to quantify the gene expression of BMP-2, BMP-4, BMP-6 and BMP-7. A General Linear Model was applied to assess statistically significant effects of factors and covariates on log transformed values of BMP2, BMP4, BMP6 and BMP7. Statistically significant differences were detected with the use of the Bonferroni criterion or the Newman – Keuls where appropriate. P-values <0.05 were considered statistically significant. Correlations between variables were assessed with the Pearson correlation coefficient. Analysis was carried out with the use of STATISTICA v.8.0. RESULTS: There was a hierarchical model of gene expression in all tested confrontations and analysis (BMP-2> BMP-6> BMP-4> BMP-7). A general suppression of gene expression of BMPs in fractures was noted comparatively to normal samples in all groups. An increase of gene expression was observed after day 30 of fracture, in all BMPs. Gene expression of distanced samples was less than normal’s but higher than the fracture site. Gene expression was lower in smokers than non smokers. Women showed higher gene expression than men. Children had higher gene expression than adults in most of BMPs and patients older than 50 years showed higher levels of gene expression than younger adults (18-49 years). No differences were found between upper and lower extremity. The size of donor bone did affect the gene expression in fractures. No difference was detected depending on the body mass index of patients in mRNA levels of BMPs. Outliers did not affect the results, and no association was revealed regarding the origin of bone sample. CONCLUSIONS: In summary, the analysis of gene expression of human periosteal BMPs highlighted the leading and primitive role of BMP-2 on the osteogenic lineage, and confirmed the osteoinductive activity of BMP-6, since BMP-6 maintained the gene expression in fractured samples in levels similar to normal samples. Moreover, it seems that bone injury negatively affects gene expression and factors such as smoking, sex, age and size of bone are able to affect in a characteristic way the levels of gene expression of periosteal growth factors. In conclusion, understanding the behavior of periosteum at the molecular level by analyzing the factors that contribute to its function (BMPs and other growth factors) during homeostasis, remodeling and healing process, will highlight its efficacy and potential use of periosteal cells, in regenerative medicine.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Το περιόστεο είναι ένα εξειδικευμένος συνδετικός ιστός ο οποίος περιβάλλει τα περισσότερα ανθρώπινα οστά. Υποστηρίζει τον οστίτη ιστό και εξασφαλίζει συνεχή παροχή νέων οστεοβλαστών για την αύξηση, επιδιόρθωση και ομοιοστασία του οστού. Η παρουσία στο περιόστεο πολυδύναμων μεσεγχυματικών κυττάρων, οστεοπρογονικών κυττάρων και αυξητικών παραγόντων, το καθιστά ένα πολύ σημαντικό ιστό για την αναγεννητική διαδικασία του οστού. Οι οστικές μορφογενετικές πρωτεΐνες (BMPs), οι οποίες εκτός των άλλων εδρεύουν και στο περιόστεο, διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο μεταξύ των αυξητικών παραγόντων στην ανάπτυξη των οστών, τον ανασχηματισμό και την διαδικασία της πώρωσης των καταγμάτων. ΥΛΙΚΟ και ΜΕΘΟΔΟΙ: Στην παρούσα διδακτορική διατριβή αναλύθηκαν οι ανθρώπινες περιοστικές BMPs και συγκεκριμένα η έκφραση των γονιδίων BMP-2, BMP-4, BMP-6 και BMP-7, σε ένα σύνολο 314 δειγμάτων περιοστέου τα οποία λήφθηκαν από ασθενείς της Ορθοπαιδικής Χειρουργικής Κλινικής του Π.Π.Γ.Ν.Λάρισας κατά τη διάρκεια επανορθωτικών χειρουργικών επεμβάσεων και έκτακτων χειρουργικών επεμβάσεων για την αποκατάσταση καταγμάτων. Το σύνολο των δειγμάτων κατηγοριοποιήθηκε σε φυσιολογικά δείγματα (n=107) και καταγματικά (n=207) εκ των οποίων τα 193 προέρχονταν από την εστία του κατάγματος και τα 14 ήταν από απόσταση από την εστία του κατάγματος. Περαιτέρω κατηγοριοποίηση ανέδειξε τις ομάδες παιδιών και ενηλίκων, ενώ μελετήθηκαν και αναλύθηκαν παράγοντες που πιθανά επηρέαζαν την έκφραση των γονιδίων που ελέγχθηκαν, ανάλογα με τα χαρακτηριστικά των ασθενών (ηλικία, φύλο, κάπνισμα, δείκτης μάζας σώματος) και τα χαρακτηριστικά των δειγμάτων (περιοχή προέλευσης-μηχανική φόρτιση, μέγεθος οστού από όπου προήλθε το δείγμα). Απομονώθηκε γενετικό υλικό από τα δείγματα, στο οποίο μέσω των τεχνικών της μοριακής βιολογίας εφαρμόστηκε ποσοτικοποίηση της έκφρασης για τα γονίδια BMP-2, BMP-4, BMP-6 και BMP-7. Για την ανίχνευση των παραγόντων που έχουν στατιστικά σημαντική επίδραση στις μετρήσεις των BMP2, BMP4, BMP6 και BMP7, χρησιμοποιήθηκαν Γενικά Γραμμικά Μοντέλα μετά από μετασχηματισμό λογαρίθμου. Τα παρατηρούμενα επίπεδα σημαντικότητας (p-values) των διαφορών εκτιμήθηκαν με το κριτήριο Bonferroni ή το Newman – Keuls ανάλογα με την ικανοποίηση ή μη των προϋποθέσεων. Το επίπεδο σημαντικότητας σε όλες τις περιπτώσεις ορίστηκε ίσο με 0.05. Συσχετίσεις μεταξύ συνεχών μεταβλητών εκτιμήθηκαν με το συντελεστή Pearson correlation coefficient. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε με το στατιστικό πακέτο STATISTICA v.8.0. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Παρατηρήθηκε ένα ιεραρχικό μοντέλο γονιδιακής έκφρασης σε όλες τις συγκρίσεις και αναλύσεις που εκπονήθηκαν (BMP-2 > BMP-6 > BMP-4 > BMP-7). Διαπιστώθηκε γενική καταστολή της έκφρασης των γονιδίων των BMPs στα κατάγματα σε σχέση με τα φυσιολογικά δείγματα σε όλες τις κατηγορίες. Σημειώθηκε αύξηση της έκφρασης μετά την 30η ημέρα του κατάγματος για όλες τις BMPs. Η γονιδιακή έκφραση των δειγμάτων από απόσταση ήταν μεγαλύτερη από αυτή των καταγμάτων εστίας αλλά μικρότερη από αυτή των φυσιολογικών. Η γονιδιακή έκφραση ήταν μικρότερη στους καπνιστές. Οι γυναίκες παρουσίασαν υψηλότερη γονιδιακή έκφραση συγκριτικά με τους άνδρες. Τα παιδιά, ως επί των πλείστον είχαν υψηλότερη έκφραση από τους ενήλικες ενώ οι ασθενείς άνω των 50 ετών έδειξαν υψηλότερα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης από του νεότερους ενήλικες (18-49 ετών). Δεν βρέθηκαν διαφορές μεταξύ άνω και κάτω άκρου. Το μέγεθος του οστού επηρέασε την έκφραση στα κατάγματα. Από την άλλη, καμία διαφορά δεν εντοπίστηκε ανάλογα με τον δείκτη μάζας σώματος των ασθενών στα επίπεδα mRNA των BMPs. Οι ακραίες τιμές δεν επηρέασαν τα αποτελέσματα και καμία συσχέτιση δεν προέκυψε ανάλογα με το οστό προέλευσης του δείγματος. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Συνοψίζοντας, από τις αναλύσεις της γονιδιακής έκφρασης των ανθρώπινων περιοστικών BMPs αναδείχθηκε ο πρωταγωνιστικός και πρώιμος ρόλος της BMP-2 στην οστεογενετική σειρά, όπως επίσης επιβεβαιώθηκε και η οστεοεπαγωγική δράση της BMP-6 αφού διατήρησε την έκφρασής της στα κατάγματα όπως αυτή που είχε στα φυσιολογικά. Επιπλέον, φάνηκε πως το γεγονός ενός οστικού τραυματισμού επηρεάζει αρνητικά την γονιδιακή έκφραση ενώ παράγοντες όπως το κάπνισμα, το φύλο, η ηλικία και το μέγεθος του οστού είναι ικανοί να επηρεάσουν χαρακτηριστικά τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης των παραγόντων του περιοστέου. Συμπερασματικά, η κατανόηση της συμπεριφοράς του περιοστέου σε μοριακό επίπεδο μέσω της ανάλυσης των παραγόντων που συμβάλλουν στο ρόλο του (BMPs και άλλων αυξητικών παραγόντων) κατά την ομοιοστασία, αναδόμηση και επουλωτική διαδικασία, θα αναδείξουν τη δυναμική του αλλά και των κυττάρων που βρίσκονται σε αυτό, ως νέα πηγή έμπνευσης και πρώτων υλών για τη νέα αναγεννητική ιατρική.