Λειτουργική μελέτη των πρωτεϊνών της οικογένειας Fras1/Frem σε φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις

Abstract

Fras1, Frem1, Frem2 and Frem3, which comprise a group of four structurally correlated proteins, are the members of the Fras1/Frem extracellular matrix protein family. With the exception of Frem3, deficiency in the individual Fras1/Frem genes gives rise to the ‘bleb’ phenotype, the hallmark features of which are embryonic dermal-epidermal detachment and subsequent formation of sub-epidermal blisters, cryptophthalmos, syndactyly and renal defects. Given Fras1/Frem structural similarities and related phenotypic defects caused by their deficiency, in the present study we concentrated on defining their localization profile during mouse embryogenesis, in order to examine if their analogous structural and functional characteristics are also reflected in their topology. Indeed, they all display a similar localization pattern in the basement membrane of all embryonic epithelia examined. Furthermore, Frem1 displayed an intracellular expression pattern in the periderm cells of the epidermis. In parallel experiments, Collagen VII, the deficiency of which results in postnatal, rather than embryonic dermal-epidermal detachment, is detected in the basal lamina of many embryonic epithelia at late embryonic stages, when Fras1/Frem levels decline. This fact led us to the interesting assumption that collagen VII compensates for the loss of Fras1/Frem in adult life and vice versa. With a view to elucidate the function of a protein, its interactions with other proteins should be examined. In vivo observations of VEGF loss from epithelial basement membrane structures in Fras1-/- embryos, urged us to examine a possible interaction between Fras1 and VEGF. In this study, for the first time we demonstrate that the first six chordin-type cysteine rich motifs of Fras1 can directly interact with VEGF and determined the regions that are essential for this interaction. For the requirements of this study, mIMCD polarised epithelial cells and the heterologous two hybrid system in Saccharomyces cereviciae were utilized. Given the fact that VEGF plays an essential role in tumour progression, we determined Fras1/Frem localization profile in chemically induced epidermal tumours. The only member of Fras1/Frem protein family that was detected in the basement membrane of neoplastic epithelia and tumour blood vessels of the underlying connective tissue was Frem3 which, as shown by RNA in situ hybridization experiments, is expressed by tumourigenic epithelia. Besides VEGF, Fras1 can also interact with the cytoplasmic protein Grip1, which targets Fras1 for secretion to the basolateral site of epithelia. Here we show that co-expression of Fras1 and Grip1 in eukaryotic cells results in endoplasmic reticulum reorganization. The ER aggregates at the points of Fras1/Grip1 co-localization. We studied this phenomenon utilizing specific intracellular markers and identified the regions of the two proteins that are causative for this ER relocation. Frem2, another member of the Fras1/Frem protein family, which has been shown to interact in vitro with Grip1, does not cause similar ER rearrangement. Thus, Fras1 appears to be the only Fras1/Frem member implicated so far in the modification of the cellular structure.

Οι πρωτεΐνες Fras1/Frem αποτελούν μία οικογένεια δομικά συγγενικών εξωκυττάριων πρωτεϊνών, που περιλαμβάνει τις πρωτεΐνες Fras1, Frem1, Frem2 και Frem3. Με την εξαίρεση της Frem3, η απενεργοποίησή τους ξεχωριστά στον ποντικό οδηγεί σε παρόμοιο φαινότυπο, το λεγόμενο ‘bleb’, που χαρακτηρίζεται από την αποκόλληση της επιδερμίδας από τη δερμίδα κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη, με αποτέλεσμα το σχηματισμό υπο-επιδερμικών πομφολυγών, κρυπτοφθαλμία, συνδακτυλίες και νεφρικές διαταραχές. Στην παρούσα εργασία, δεδομένης της δομικής ομολογίας των Fras1/Frem και των παρόμοιων φαινοτυπικών διαταραχών που προκύπτουν από την απενεργοποίησή τους, πραγματοποιήθηκε μία ανοσοϊστοχημική μελέτη εντοπισμού τους κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη του ποντικού, ώστε να διαπιστωθεί κατά πόσο παρόμοιο είναι και το πρότυπο εντοπισμού τους στα εμβρυϊκά στάδια. Πράγματι, διαπιστώθηκε ότι η τοπολογία τους είναι κοινή, καθώς όλες εντοπίστηκαν στη βασική μεμβράνη μιας πληθώρας επιθηλιακών δομών. Επιπλέον, η Frem1 εμφάνισε ένα ενδοκυτταρικό πρότυπο έκφρασης στα περιδερμικά κύτταρα της επιδερμίδας. Σε παράλληλα πειράματα, το κολλαγόνο VII, του οποίου η απενεργοποίηση οδηγεί σε παρόμοιο φαινότυπο με αυτό των Fras1/Frem, με τη διαφορά ότι αυτός παρατηρείται μόνο μετά τη γέννηση, ανιχνεύτηκε στα όψιμα στάδια της εμβρυϊκής ανάπτυξης, όταν τα επίπεδα των Fras1/Frem αρχίζουν να φθίνουν. Το γεγονός αυτό μας οδήγησε στην υπόθεση ότι το ρόλο των Fras1/Frem κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη τον διαδραματίζει το κολλαγόνο VII στον ενήλικα οργανισμό και το αντίθετο. Στην κατανόηση της λειτουργικής δράσης των πρωτεϊνών συμβάλλει και η ταυτοποίηση των αλληλεπιδράσεων στις οποίες συμμετέχουν. In vivo παρατηρήσεις που αφορούσαν την απώλεια του αγγειογενετικού αυξητικού παράγοντα VEGF από τη βασική μεμβράνη των επιθηλίων των Fras1-/- έμβρύων, μας οδήγησαν στη διερεύνηση της αλληλεπίδρασης των πρωτεϊνών Fras1 και VEGF. Στα πειράματά μας αποδείχθηκε για πρώτη φορά, ότι τα έξι πρώτα πρωτεϊνικά μοτίβα τύπου χορδίνης της Fras1 αλληλεπιδρούν με τον VEGF, και ταυτοποιήθηκαν οι περιοχές της Fras1 και του VEGF που είναι κρίσιμες για την αλληλεπίδραση αυτή. Τα σύστηματα μελέτης που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα πολωμένα επιθηλιακά κύτταρα mIMCD και το ετερόλογο σύστημα δύο υβριδίων στο σακχαρομύκητα. Δεδομένου ότι ο VEGF διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη δημιουργία νεοπλασιών, πραγματοποιήθηκε επιπλέον ο προσδιορισμός του προτύπου έκφρασης της Fras1 και των υπολοίπων πρωτεϊνών Fras1/Frem σε χημικά επαγώμενους όγκους της επιδερμίδας. Διαπιστώθηκε ότι το μοναδικό μέλος της οικογένειας που ανιχνεύεται στη βασική μεμβράνη των νεοπλαστικών επιθηλίων και των παθολογικών αιμοφόρων αγγείων του συνδετικού ιστού είναι η πρωτεΐνη Frem3. Με πειράματα in situ υβριδισμού διαπιστώθηκε ότι το γονίδιο Frem3 εκφράζεται από τα καρκινικά επιθήλια. Εκτός από τον VEGF, η πρωτεΐνη Fras1 αλληλεπιδρά μέσω του καρβοξυτελικού της άκρου με την κυτταροπλασματική πρωτεΐνη Grip1, η οποία τη στοχεύει προς έκκριση στη βασικοπλευρική μεριά των επιθηλίων. Στα πλαίσια της μελέτης της αλληλεπίδρασης αυτής, βρέθηκε ότι κατά τη συνέκφραση των Fras1 και Grip1 σε ευκαρυωτικά κύτταρα, πραγματοποιείται μία αναδιοργάνωση του ενδοπλασματικού δικτύου των κυττάρων, με αποτέλεσμα να συγκεντρώνεται στις περιοχές συνεντοπισμού των δύο παραπάνω πρωτεϊνών. Η αναδιοργάνωση αυτή χαρακτηρίστηκε με συγκεκριμένους ενδοκυτταρικούς μάρτυρες και ταυτοποιήθηκαν οι περιοχές των δύο πρωτεϊνών που είναι υπεύθυνες για την πρόκληση του φαινόμενου αυτού. To γεγονός ότι η Frem2, μία πρωτεϊνη της οικογένειας των Fras1/Frem πρωτεϊνών που έχει δειχθεί in vitro ότι αλληλεπιδρά με τη Grip1 δεν φάνηκε στις μελέτες μας να προκαλεί αντίστοιχο φαινόμενο, φανερώνει ότι η Fras1 είναι η μοναδική πρωτεΐνη της οικογένειας Fras1/Frem που πιθανόν εμπλέκεται στον καθορισμό της κυτταρικής δομής.