Αναστολή της ενεργοποιημένης κινάσης της τυροσίνης JAK2 λόγω της σημειακής μετάλλαξης V617F στα χρόνια μυελοϋπερπλαστικά σύνδρομα

Abstract

Chronic Myeloproliferative Disorders CMPDs, which were first reported by Dameshek in 1951, are clonal hematopoietic stem cell disorders characterized by proliferation of 1 or more myeloid cell lineages in the bone marrow and increased numbers of mature or immature cells in peripheral blood. According to the Word Health Organization, CMPDs or Myeloproliferative Neoplasms MPNs, include Polycythemia Vera (PV), Essential Thrombocythemia (ET), Idiopathic Myelofibrosis (IMF), plus rarer subtypes such us chronic neutrophilic leukaemia (CNL), hypereosinophilic syndrome (HES) and chronic eosinophilic leukaemia (CEL). The identification in 2005 of the V617F mutation in the JAK2 gene in Chronic Myeloproliferative Disorders (CMPDs) or Myeloproliferative Neoplasms (MPNs ) may explain several characteristics of these diseases and provide a prognostic marker in clinical practice. The JAK2V617F mutation is present in 90% of Polycythemia Vera, PV, patients and in about a half of Essential Thrombocythemia, ET, and Idiopathic Myelofibrosis, IMF, patients respectively. The first purpose of this study was the investigation of the V617F mutation of the JAK2 gene in our patients and the correlation between the clinical phenotype of patients with the JAK2V617F mutation and without. Also, is important to evaluate the mutation load of the V617F mutated alleles in all patients and to find the correlation between the mutation load and the clinical phenotype of the patients. Secondly, we evaluate the mutation load of the V617F mutated alleles in PV patients after a treatment with the pegylated forms of INFa-2a. The second purpose of this study was the investigation of the mutations of the exon 12 of the JAK2 gene in the negative cases for the V617 mutation in PV. The third purpose of this study was the investigation of the mutations in the thrombopoietin receptor-MPL in the negative cases for the V617 mutation in ET and IMF samples. Patients were found to carry the V617F mutation in the exon 14 of the JAK2 gene and the other patients were negative. The proportion of positive cases per disease sutype was PV 434/480 (90.5%), IMF 9/18 (50%) and ET 525/880 (60%). The negative patients for the V617F mutation was PV 46/480 (9.5%), ET 355/880 (40%) and IMF 9/18 (50%) were searched for the exon 12 mutation of the JAK2 gene (N542-E543del, K539L, F537-K539delInsL, H538QK539L) and for mutation in the thrombopoietin receptor (MPLW515L/W515K). These mutations were detected using the allele-specific real-time polymerase chain reaction (AS-PCR) assay described by (Scott et al, 2007). The conclusions of our study: • Investigation of the JAK2V617F mutation in patients with PV, IMF, and ET. Correlations between the clinical phenotype of patients with or without the mutation. We observed that the clinical phenotype of the PV patients carried the JAK2V617F mutation had a increased level of WBC, PLT count and Hct level, but not in the level of the Hb. In the IMF patients we did not observed any differences. In the ET patients we observed that the level of the Hb, WBC and PLT count was increased. • Investigation of the mutation load of the V617F mutated alleles in patients with PV, IMF, and ET. Correlations between the mutation load of the V617F mutated alleles and the clinical phenotype of the patients. We observed an increased level of mutated alleles, more than 50% in PV patients. Instead the level of the mutated alleles in ET patients were lower (less than 50%). Also the level of the mutated alleles in IMF patients were highest from the ET and PV patients. We observed in PV patients correlation between the mutation load and the level of the Hb, Hct and WBC count and in ET patients between the mutation load and the level of the Plt count. • The conclusion, of the purpose of this study, has been carried out in 5 PV patients treated with the pegylated forms of the IFN-a-2a. The reduction of the mutation load started during the first year and it became undetectable after the 24 months of treatment a trend reported in (Kiladjian et al, 2008). Interestingly, of the previous report one of the responders had an increase of the mutation load during the treatment 19 with peg-IFNa-2a, and after a continuous therapy was able to achieve a molecular response. This observation is in agreement with the report of (Kiladjian et al, 2008) that a prolonged treatment with the peg-IFNa-2a would lead to an increase reduction of the mutation load of the JAK2V617 mutation. The complete and a partial molecular response was obtained of 4/5 patients with a rate of 80%. In this subset of patients the complete molecular remission was followed by a complete hematologic remission. Interestingly, of previous report, one of the five patients was unable to achieve a molecular response followed by a non hematologic reduction (Kiladjian et al, 2008). Similarly, of the recent report, one patient was able to maintain the molecular response for at least 6 months after the last treatment with peg-IFNa-2a (Larsen et al, 2008).The hematologic response was rapidly achieved in contrast to the molecular response. The hematologic response started after 6 months of treatment. A major complete response with a reduction in of all the blood parameters was achieved at least 12 months from the start point of the therapy. The complete molecular response rate was 80% for the group of PV patients. One of the responders was able to maintain the hematologic response for at least 6 months after the last treatment with peg-IFNa-2a. In conclusion, a prolonged therapy with peg-IFNa-2a administrated in a standard dose, provide in PV patients a reduction of the mutation load of the JAK2V617F mutation and in some cases the complete disappearance of the mutated alleles. This observation maybe is a tool of monitor the treatment efficacy of PV patients. • The conclusion, of the second purpose of this study has been carried out in 46 PV patients negative for the V617F mutation. The proportion of positive cases for the mutations of the exon 12 (N542-E543del, K539L, H538QK539L, F537-K539delInsL) were 3/46(6,5%), 1/46 (2,1), 1/46(2,1),none respectively. These patients was characterized by high level of Hct and Hb, mild leukocytosis and normal level of Platelet count. Correlation between positive cases for the mutations of the exon 12 and positive cases for the mutation of the JAK2V617F has show differences in the clinical phenotype. Specifically, differences were observed in the WBC count and the level of the Hct and Hb, but not in the PLT count. • The conclusion, of the third purpose of this study has been carried out in 364 patients, ET 355/364 (97%) and IMF 9/364 (3%) negative for the V617F mutation. The proportion of positive cases for the mutations in the thrombopoietin receptor (MPLW515L/W515K) were ET 23/355 (6.3%) and IMF 1/9 (0.2%). The MPLW515L mutation was found in 20 samples (5.4%) and the MPLW515K in 4 samples (1.09%). These patients was characterized by high level of the platelet count, normal level of the Hct and Hb and mild leukocytosis. Correlation between positive cases for the mutation MPLW515L and W515K has show that the patients carrying the MPLW515L mutation have a clinical phenotype characterized by an increased level of Hct and lower level of WBC count. The level of the PLT count was the same in these two groups of patients. Correlation between positive cases for the mutations of the thrombopoietin receptor and positive cases for the mutation of the JAK2V617F has show that the level of PLT, WBC and Hct were lower.

Τα Χρόνια Μυελοϋπερπλαστικά Σύνδρομα (ΧΜΥΣ) ή Χρόνια Μυελοϋπερπλαστικά Νεοπλάσματα (ΧΜΥΝ) είναι κλωνικές διαταραχές που χαρακτηρίζονται από τον άμετρο, αναίτιο και άσκοπο πολλαπλασιασμό μιας ή περισσοτέρων αιμοποιητικών σειρών. Οφείλονται σε μετασχηματισμό των αντίστοιχων πολυδύναμων αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων και περιλαμβάνουν την Χρόνια Μυελογενή Λευχαιμία (ΧΜΛ), την Αληθή Πολυκυτταραιμία (ΑΠ), την Ιδιοπαθή θρομβοκυτταραιμία (ΙΘ), και την Ιδιοπαθή Μυελοσκλήρυνση (IM). Σύμφωνα με το Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας, στη κατηγορία των μυελοϋπερπλαστικών διαταραχών περιλαμβάνονται επίσης η Χρόνια Ηωσινοφιλική Λευχαιμία (Chronic Eosinophilic Leukemia, CEL), το Ιδιοπαθές Υπερηωσινοφιλικό Σύνδρομο (Idiopathic Hypereosinophilic Syndrome, HES) και η Χρόνια Ουδετεροφιλική Λευχαιμία. Τα Χρόνια Μυελοϋπερπλαστικά Σύνδρομα (ΧΜΥΣ) ή Χρόνια Μυελοϋπερπλαστικά Νεοπλάσματα (ΧΜΥΝ) χαρακτηρίζονται από την αναγνώριση το 2005 της μετάλλαξης V617F στο γονίδιο JAK2 . Η σημειακή μετάλλαξη V617F εντοπίζεται στο εξόνιo 14 του γονιδίου JAK2, όπου η βαλίνη αντικαθίσταται, σε επίπεδο πρωτεΐνης, από φαινυλαλίνη ως αποτέλεσμα της μετάλλαξης της γουανίνης σε θυμίνη σε επίπεδο DNA. Η μετάλλαξη εντοπίζεται στη ρυθμιστική περιοχή JH2 του γονιδίου JAK2 και βρέθηκε σε ποσοστό 90% σε ασθενείς με ΑΠ και, σε μικρότερα ποσοστά, σε ασθενείς με IM (50%) και ΙΘ (60%). Σκοπός της μελέτης, είναι η ανίχνευση της μετάλλαξης V617F του γονιδίου JAK2 και η μελέτη του κλινικού φαινότυπου των ασθενών με την μετάλλαξη. Επίσης γίνεται ποσοτικός προσδιορισμός των μεταλλαγμένων αλληλομόρφων V617F σε ασθενείς με ΧΜΥΣ και συσχέτιση αυτών με τα αιματολογικά χαρακτηριστικά τους. Στόχος είναι να οριστεί το ‘’φορτίο μοριακής νόσου’’ όλων των ασθενών με ΧΜΥΣ 16 και κυρίως των ασθενών με ΑΠ κατά την διάρκεια της θεραπείας τους με το φαρμακευτικό σκευάσμα της ιντερφερόνης (peg-IFNa-2a). Ένας άλλος στόχος της μελέτης αυτής, είναι η ανίχνευση των μεταλλάξεων στο εξόνιο 12 του γονιδίου JAK2 σε ασθενείς με ΑΠ και η ανίχνευση των μεταλλάξεων του υποδοχέα της θρομβοποιητίνης (MPL) σε ασθενείς με ΙΘ και ΙΜ, που είναι αρνητικοί για την μετάλλαξη JAK2V617F. Για το λόγο αυτό μελετήσαμε ασθενείς με ΧΜΥΣ. Σε αυτούς τους ασθενείς έγινε ανίχνευση της μετάλλαξης JΑΚ2V617F. Η ανίχνευση της μετάλλαξης έγινε με την μέθοδο Amplification Refractory Mutation System-polymerase chain reaction (ARMs-PCR) σε δείγματα DNA ασθενών, που είχαν απομονωθεί από περιφερικό αίμα. Ο ποσοτικός προσδιορισμός της μετάλλαξης JΑΚ2V617F έγινε σε δείγματα αίματος ή μυελού με το Πρόγραμμα Ανάλυσης Εικόνας (Image quant software). Με τον τρόπο αυτό προσδιορίζεται η οπτική πυκνότητα της ζώνης του μεταλλαγμένου, του φυσιολογικού αλληλομόρφου JAK2 και της ζώνης αναφοράς.Το ποσοστό των μεταλαγγμένων αλληλομόρφων JAK2 υπολογίζεται με βάση πρότυπες καμπύλες που κατασκευάζονται με μαθηματική προσέγγιση από DNA που απομονώθηκε από περιφερικό αίμα ασθενούς (αρνητική στην μετάλλαξη JΑΚ2V617F) και από την κυτταρική σειρά HEL που χαρακτηρίζεται από την μετάλλαξη JΑΚ2V617F. Τα αποτελέσματα της μελέτης συνοψίζονται ως εξής: B1. Ανίχνευση της μετάλλαξης JΑΚ2V617F σε ασθενείς με ΑΠ, ΙΘ και ΙΜ. Μελετήθηκαν 1378 ασθενείς, οι οποίοι πληρούσαν τα κριτήρια WHO για την κατάταξή τους σε ΑΠ, ΙΘ και ΙΜ. Διαπιστώθηκαν 968 ασθενείς θετικοί και 410 ασθενείς αρνητικοί για την μετάλλαξη, με την ακόλουθη κατανομή: ΑΠ 434/480 (90.5%), ΙΘ 525/880 (60%) και IM 9/18 (50%). Το ποσοστό των ασθενών χωρίς την μετάλλαξη JΑΚ2V617F είναι: ΑΠ 46/480 (9.5%), ΙΘ 355/880(40%) και IM 9/18 (50%). Συγκεκριμένα: Β2. Ποσοτική ανάλυση του ποσοστού των μεταλλαγμένων αλληλομόρφων JAK2V617F για τους ασθενείς με ΑΠ, ΙΘ και ΙΜ. Το ποσοστό του μεταλλαγμένου γονιδίου JAK2V617F μελετήθηκε σε 87 ασθενείς με ΑΠ, 50 ασθενείς με ΙΘ και 9 ασθενείς με ΙΜ. Το ποσοστό των αλληλομόρφων JAK2V617F ήταν σαφώς υψηλότερο στην ομάδα ΑΠ και εξαιρετικά υψηλό στην ομάδα ΙΜ. Β3. Σύγκριση των αιματολογικών παραμέτρων σε ασθενείς με ΑΠ και ΙΜ θετικούς ή αρνητικούς για την μετάλλαξη JAK2V617F Από το σύνολο των 434 ασθενών με ΑΠ, μελετήθηκαν συγκριτικά 43 δείγματα θετικά και 34 δείγματα αρνητικά για την μετάλλαξη JAK2V617F. Από την ομάδα των ασθενών με ΙΘ μελετήθηκαν 105 δείγματα θετικά και 71 αρνητικά για την μετάλλαξη, ενώ από τους ασθενείς με ΙΜ μελετήθηκαν 9 θετικά και 9 αρνητικά για την μετάλλαξη JAK2V617F δείγματα. Ευρήματα : Στην ομάδα ΑΠ δεν αναδείχθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ (+) και (-) ασθενών όσον αφορά τα επίπεδα αιμοσφαιρίνης. Αντίθετα, στους (+) ασθενείς τα επίπεδα λευκών αιμοσφαιρίων και αιμοπεταλίων είναι σαφώς υψηλότερα των αντίστοιχων επιπέδων στους (-) ασθενείς. Στην ομάδα ΙΘ όλες οι αιματολογικές παράμετροι ήταν σαφώς υψηλότερες στην ομάδα JAK2V617F (+) σε σχέση με αυτές της ομάδας JAK2V617F (-). Οι διαφορές ήταν στατιστικά σημαντικές. Στην ομάδα IM δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των δυο ομάδων, ο αριθμός όμως είναι μικρός για να οδηγήσει σε σαφή συμπεράσματα. Β4. “Φορτίο νόσου” (ποσοστό μεταλλαγμένων αλληλομόρφων του γονιδίου JAK2) στα μελετηθέρντα ΧΜΚΥΣ Μελετήθηκαν 38 ασθενείς με ΑΠ, 50 ασθενείς με ΙΘ και 9 ασθενείς με ΙΜ. Όλοι πληρούσαν τα κριτήρια διάγνωσης του WHO και, εξ’ ορισμού, όλοι ήταν θετικοί για την μετάλλαξη JAK2V617F, Τα αποτελέσματα συνοψίζονται στο ότι, παρά την μεγάλη διακύμανση, οι μέσες και διάμεσες τιμές του φορτίου νόσου ήταν μεγαλύτερες του 50%. Β5. Συσχέτιση των αιματολογικών παραμέτρων με το ποσοστό των μεταλλαγμένων αλληλομόρφων JAK2V617F σε κάθε κατηγορία ασθενών Ευρήματα : Στην ομάδα ΑΠ το φορτίο νόσου σχετίζεται θετικά (p < 0.01) με τα επίπεδα αιμοσφαιρίνης, αιματοκρίτη, λευκών αιμοσφαιρίων και αιμοπεταλίων. Στην ομάδα ΙΘ η συσχέτιση αυτή είναι αμβλύτερη (τιμές p 0.02 έως 0.050), ενώ Στην ομάδα ΙΜ δεν υπήρχε τέτοια συσχέτιση, αν και ο αριθμός των δειγμάτων ήταν πολύ μικρός. Β6. Διερεύνηση μεταλλάξεων στο εξόνιο 12 του γονιδίου JAK2 σε ασθενείς με ΑΠ που είναι αρνητικοί για την μετάλλαξη JAK2V617F. 17 Από το σύνολο των 46 ασθενών με ΑΠ, οι οποίοι ήσαν αρνητικοί για την μετάλλαξη JAK2V617F, 34 ασθενείς υποβλήθηκαν σε πλήρη έλεγχο για την παρουσία των μεταλλάξεων N542-E543del, F537- K539delinsL, H538QK539L, και K539L. Χρησιμοποιήθηκε η τεχνική Allele Specific PCR. Διαπιστώθηκαν 5 ασθενείς που έφεραν μεταλλάξεις στο εξόνιο 12 του γονιδίου JAK2 (14,7%), και συγκεκριμένα 4 φορές η μετάλλαξη Ν542-E543del (ποσοστό 10,8% ), 1 φορά (ποσοστό 2.1%) η μετάλλαξη H538QΚ539L και 1 φορά (ποσοστό 2.1%) η μετάλλαξη K539L. Η μετάλλαξη F537- K539delinsL δεν ανιχνεύθηκε σε κανέναν ασθενή. Συσχέτιση αποτελεσμάτων με τον κλινικό φαινότυπο των ασθενών : Τα επίπεδα αιμοσφαιρίνης και αιματοκρίτη είναι σαφώς αυξημένα όπως αναμένεται. Αντίθετα, 3 ασθενείς εμφανίζουν λευκοκυττάρωση και 2 θρομβοκυττάρωση που δεν αναμένονται σύμφωνα με την προσιτή βιβλιογραφία. Β6.1. Σύγκριση του κλινικού φαινοτύπου ασθενών με τις μεταλλάξεις στο εξόνιο 12 του γονιδίου JAK2 με ασθενείς που είναι θετικοί στην μετάλλαξη JAK2V617F και με ασθενείς που ήταν αρνητικοί και για τις δυο μεταλλάξεις. Διαπιστώσαμε ότι οι ασθενείς με τις μεταλλάξεις στο εξόνιο 12 του γονιδίου JAK2 χαρακτηρίζονται κυρίως από αυξημένα επίπεδα αιματοκρίτη, αιμοσφαιρίνης και λευκών αιμοσφαιρίων σε σχέση με τους ΑΠ ασθενείς που είναι θετικοί της μετάλλαξης JAK2V617F και με τους ασθενείς που είναι αρνητικοί των μεταλλάξεων. Αντίθετα τα επίπεδα των αιμοπεταλίων των ασθενών με τις μεταλλάξεις στο εξόνιο 12 του γονιδίου JAK2 είναι πιο χαμηλά από τους ασθενείς με την μετάλλαξη JAK2V617F και πιο υψηλά από τους αρνητικούς ασθενείς. Β7. Διερεύνηση μεταλλάξεων στο γονίδιο MPL σε ασθενείς με ΙΘ και IM που είναι αρνητικοί για την μετάλλαξη JAK2V617F 355 ασθενείς με ΙΘ και 9 ασθενείς ΙΜ αρνητικοί για την μετάλλαξη JAK2V617F ελέγχθηκαν με την τεχνική Allele Specific PCR για τις μεταλλάξεις W515L και W515K του γονιδίου MPL (υποδοχέας θρομβοποιητίνης). 24 ασθενείς (23 με ΙΘ και 1 με ΙΜ) (6,5% συνολικά) αποδείχθηκαν φορείς τέτοιων μεταλλάξεων. Ειδικότερα, αναγνωρίσθηκαν : η μετάλλαξη W515L σε ποσοστό 5,4% (20/364) και η μετάλλαξη W515K σε ποσοστό 1,09% (4/364). Β7.1. Σύγκριση του κλινικού φαινοτύπου ασθενών με τις μεταλλάξεις στον υποδοχέα της θρομβοποιητίνης W515K/W515L με ασθενείς με την μετάλλαξη JAK2V617F και με ασθενείς που ήταν αρνητικοί και για τις δυο μεταλλάξεις. Η σύγκριση κλινικού φαινοτύπου ασθενών της πρώτης και της τρίτης ομάδας διαπιστώνει ότι η πρώτη ομάδα έχει αυξημένα επίπεδα λευκών αιμοσφαιρίων και αιμοσφαιρίνης, ενώ τα επίπεδα των αιμοπεταλίων δεν παρουσιάζουν στατιστικά σημαντικές διαφορές. Η σύγκριση κλινικού φαινοτύπου ασθενών της πρώτης και της δεύτερης ομάδας διαπιστώνει ότι ο αριθμός των λευκών αιμοσφαιρίων, τα επίπεδα της αιμοσφαιρίνης και τα επίπεδα των αιμοπεταλίων της πρώτης ομάδας είναι χαμηλά. Επίσης παρατηρείται ότι η αύξηση της ηλικίας είναι μεγαλύτερη στους ασθενείς με τις μεταλλάξεις του υποδοχέα της θρομβοποιητίνης από τους ασθενείς με την μετάλλαξη JAK2V617F και από τους ασθενείς που είναι αρνητικοί και για τις δυο μεταλλάξεις. Στην σύγκριση κλινικού φαινοτύπου ασθενών της δεύτερης και της τρίτης ομάδας διαπιστώσαμε αύξηση των επιπέδων της αιμοσφαιρίνης, του αριθμού των λευκών αιμοσφαιρίων και αιμοπεταλίων, στατιστικά σημαντική στους ασθενείς με την μετάλλαξη JAK2V617F. Β8. Παρακολούθηση των επιπέδων του μεταλλαγμένου γονιδίου JAK2V617F κατά την διάρκεια της θεραπείας ασθενών με ΑΠ με υδροξυουρία και α-ιντερφερόνη Μελετήθηκε η δράση της υδροξυουρίας όσον αφορά την μείωση του φορτίου μοριακής νόσου σε κυτταρικές σειρές Κ562 (αλληλόμορφα αρνητικά για την μετάλλαξη JAK2V617F) και HEL (μεταλλαγμένα αλληλόμορφα- V617F σε ομοζυγωτία) καθως και στο περιφερικό αίμα ασθενών με ΑΠ θετική για την μετάλλαξη JAK2V617F που έπαιρναν το φάρμακο. Μείωση του φορτίου μοριακής νόσου δεν παρατηρήθηκε σε κανένα από τα παραπάνω πειράματα. Αντίθετα, η χορήγηση α-ιντερφερόνης σε ασθενείς με αληθή πολυκυτταραιμία ακολουθήθηκε, συνήθως μετά δίμηνο, από προοδευτική σαφή μείωση του φορτίου μοριακής νόσου. Σε αρκετές περιπτώσεις η μείωση ήταν τόσο σημαντική, ώστε το φορτίο νόσου να μην ανιχνεύεται (μοριακή “ύφεση”) . Τα επίπεδα του γονιδίου JAK2V617F παρέμειναν χαμηλά επί αρκετούς μήνες μετά την διακοπή του φαρμάκου, έπειτα όμως αυξήθηκαν μαζί με την αύξηση του αιματοκρίτη.