Μελέτη πρωτεϊνών επαγουσών την κυτταρική επιβίωση σε μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα

Abstract

Aim: The aim of this study is to investigate factors that are involved in the survival and expansion of neoplastic clone in myelodysplastic syndromes although they are characterized by increased apoptosis of hemopoietic cells. This survival process leads to accumulation of immature cells (blasts) and disease progression to acute leukaemia. Introduction: In early stages of the disease the neoplastic clone do not present surviving advantages over the normal hemopoietic cells. The expansion of the MDS clone is achieved after an immune insult of the normal bone marrow. During disease progress mutations are accumulated that produce survival advantage and maturation arrest to the neoplastic clone. Survivin is an apoptosis inhibitor not expressed in normal cells but found expressed in neoplastic cells in various tumours and has been associated to cell proliferation and survival. Materials and Methods: One hundred and forty-two patients (87 males and 55 females) with median age 72 years as well as 53 healthy controls (22 males and 35 females) with median age 74 years were involved in the study. The expression of survivin was studied in the CD34+ cells of the bone marrow using real-time pcr. Mutation analysis was done to the survivin cDNA using Sanger’s method for direct sequencing. The levels of survivin in cell eluate from bone marrow CD34+ cell cultures were measured using ELISA(Cell Signalling Tecnology,Geneway Biotech, R&D). In addition the expression of genes involved in the apoptosis pathway and NFk-B pathway using commercially available cDNA microarrays(Taqman®).Results: We found that the survivin levels in the cell eluate from cell cultures of isolated CD34+ bone marrow cells from patients with high/intermediate-2 risk MDS had mean(±SD) value 536.37±159.208pg/ml while in the low/intermediate-1risk MDS the corresponding value was 177.58±58.87 pg/ml. In the control group the survivin levels were not detectable. The levels of survivin in the high/intermediate-2 group were statistically significantly higher than those in the low/intermediate-1 group (p<0.001).The expression of survivin (number of transcripts) was higher in MDS of high/intermediate-2 group than in MDS of low/intermediate-1 group (p<0.001). The expression of survivin in low/intermediate-1 was significantly higher than in the normal controls(p<0.001). Mutations were not detected in survivin gene with direct sequencing.No statistically significant difference was detected in the expression of the various genes of the microarray of the NFk-B pathway used among the various studied groups(p=0.2)The genes AIFM1, AKT1, APAF1, ATM,BAD, BBC3, BID, CASP3, CASP7, CASP8, CASP9, CYCS, DAPK3, DAXX,DFFA, DFFB, P53AIP1 that induce apoptosis were found overexpressed in the low/intermediate-1 group compared to the high/intermediate-2 group and normal controls(p<0.001)Conclusions: Survivin is overexpressed in MDS cells although these cells present increased apoptosis compared to the normal cells. Taking in account that survivin induces cell proliferation and inhibits apoptosis it is suggested that other possible factors influence the balance between survival or death in the difference stages of the disease evolution.

Σκοπός της μελέτης είναι ο εντοπισμός παραγόντων που βοηθούν στην επιβίωση των νεοπλασματικών κυττάρων στα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα παρά το γεγονός, ότι αυτά παρουσιάζουν αυξημένο ρυθμό απόπτωσης. Η επιβίωση οδηγεί στην παραμονή του κλώνου και σταδιακά στην συσσώρευση αωρότερων μορφών και στην εξέλιξη της νόσου σε οξεία λευχαιμία. Εισαγωγή: Τα MDS είναι ετερογενής κατηγορία νοσημάτων που χαρακτηρίζονται από μη αποδοτική αιμοποίηση και συχνή εξέλιξη σε οξεία λευχαιμία. Στα αρχικά στάδια της νόσου ο νεοπλασματικός κλώνος δεν παρουσιάζει πλεονέκτημα επιβίωσης σε σχέση με τα φυσιολογικά κύτταρα και η επικράτησή του οφείλεται σε ανοσολογική βλάβη του φυσιολογικού αιμοποιητικού ιστού. Κατά την εξέλιξη της νόσου συσσωρεύονται μεταλλάξεις που προσδίδουν πλεονέκτημα επιβίωσης και αναστολή της ωρίμανσης. Η survivin είναι μία πρωτεḯνη που ανήκει στην οικογένεια των ανασταλτών της απόπτωσης (IAP proteins) και εμπλέκεται στην επαγωγή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Η πρωτεḯνη αυτή εκφράζεται φυσιολογικά σε εμβρυικούς ιστούς και παθολογικά σε αρκετά νεοπλάσματα σχετιζόμενη με δυσμενή πρόγνωση. Υλικό και μέθοδοι: Περιλήφθηκαν 142 ασθενείς (87 άνδρες και 55 γυναίκες) με διάμεση ηλικία 72 έτη καθώς και 53 υγιείς μάρτυρες (22 άνδρες και 35 γυναίκες) με διάμεση ηλικία 74 ετών. Μελετήθηκε η έκφραση της survivin σε CD34+ κύτταρα του μυελού των οστών με real-time pcr. Έλεγχος μεταλλάξεων στο cDNA της surviving έγινε με ανάλυση νουκλεοτιδικής αλληλουχίας κατά Sanger. Επίσης μελετήθηκαν τα επίπεδα της survivin σε εκχυλίσματα CD34+ κυττάρων από καλλιέργειες μυελού των οστών. Παράλληλα μελετήθηκε η έκφραση γονιδίων, που εμπλέκονται στην οδό της απόπτωσης και στην οδό NF-kB σε μικροσυστοιχίες cDNA με real-time pcr. Χρησιμοποιήθηκαν εμπορικά κατασκευασμένες μικροπλάκες pcr μικροσυστοιχιών cDNA Taqman®. Αποτελέσματα: Διαπιστώθηκε, ότι τα επίπεδα survivin στα εκλυλίσματα καλλιεργειών κυττάρων από ασθενείς με MDS υψηλού/ενδιάμεσου-2 κινδύνου η μέση τιμή ήταν 536,37±159,208 pg/ml ενώ στα χαμηλού/ενδιαμέσου-1 κινδύνου ήταν 177,59±58,87 pg/ml. Στην ομάδα των μαρτύρων survivin δεν ήταν ανιχνεύσιμη σε κανένα περιστατικό. Τα επίπεδα survivin στην ομάδα ασθενών υψηλού/διαμέσου-2 κινδύνου ήταν στατιστικά σημαντικά υψηλότερα από τα αντίστοιχα επίπεδα στους ασθενείς χαμηλού/διαμέσου-1 κινδύνου (p<0.001). Η έκφραση survivin (αριθμός μεταγράφων) ήταν υψηλότερη στα MDS υψηλού/διαμέσου-2 κινδύνου από ότι στα χαμηλού/διαμέσου-1 κινδύνου(p<0.001). Επίσης η έκφραση μεταξύ MDSχαμηλού/διαμέσου-1 κινδύνου ήταν σημαντικά υψηλότερη από ότι στα φυσιολογικά άτομα (p<0.001). Δεν διαπιστώθηκαν μεταλλάξεις στο γονίδιο της survivin με direct sequencing. Δεν διαπιστώθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στην έκφραση των διαφόρων γονιδίων της κυτταρικής οδού του NFkB(μικροσυστοιχίες cDNA) μεταξύ των διαφόρων ομάδων ασθενών και των φυσιολογικών μαρτύρων (p=0.2).Τα γονίδια AIFM1, AKT1, APAF1, ATM,BAD, BBC3, BID, CASP3, CASP7, CASP8, CASP9, CYCS, DAPK3, DAXX,DFFA, DFFB, P53AIP1, που προάγουν την απόπτωση βρέθηκαν να υπερεκφράζονται στα χαμηλού/διαμέσου-1 κινδύνου και να υποεκφράζονται στα υψηλού/διαμέσου-2 κινδύνου σύνδρομα σε σχέση με τους φυσιολογικούς μάρτυρες(p<0.001). Συμπεράσματα: H survivin υπερεκφράζεται στα MDS κύτταρα παρά το γεγονός, ότι αυτά παρουσιάζουν αυξημένο ρυθμό απόπτωσης. Δεδομένης της αναστολής της απόπτωσης και της προαγωγής από την πρωτεΐνη survivin του κυτταρικού πολλαπλασιασμού πιθανολογείται, ότι άλλοι παράγοντες επιδρούν και ρυθμίζουν την ισορροπία υπέρ η κατά της επιβίωσης των κυττάρων στα διάφορα στάδια εξέλιξης της νόσου.