Ανάπτυξη επαναλαμβανόμενων ολιγοπεπτιδικών φορέων για διαγνωστικούς ελέγχους και εμβόλια έναντι του ιού της γρίπης των πτηνών

Abstract

The entry of influenza virus into susceptible cells is mediated by the viral hemagglutinin (HA) glycoprotein which constitutes the major surface antigen against which neutralizing antibodies are directed. The receptor binding preference of influenza viruses correlates with the animal species from which the viruses are isolated. Human isolates preferentially bind to the terminal sialic acid of glycoprotein and glycolipid receptors with a2,6 linkages to galactose (SAa2,6Gal) whereas avian isolates prefer a2,3 linkages (SAa2,3Gal). Aiming to contribute in the development of an influenza vaccine several SOCT cell epitope conjugates were synthesized and tested for their immunogenicity in mice after challenge infection with influenza virus. The influenza hemagglutinin CD8 Τ cell epitopes were predicted by computational methods and were then coupled on the SOC₄-I carrier in two copies in order to improve their immunogenicity. The desired macromolecules of branched architecture were obtained either by using the step by step Boc/Bzl solid phase peptide synthesis or by the chemoselective ligation approach through oxime bond formation between the appropriately modified for this purpose peptide fragments. Mice immune response to these SOC-T cell epitope conjugates was not adequate to induce protective immunity against influenza infection. Moreover, this work also aims to contribute in the development of highly specific and sensitive biological assays for the diagnosis and discrimination between avian and human influenza viruses. To this end, we synthesized four glycopeptide analogs mimicking the hemagglutinin receptor. Their synthesis was achieved via a chemoselective ligation approach which generates an oxime bond between the Νε- aminooxyacetylated- SOC₄-I oligopeptide carrier and the carbonyl group at the reducing end of different sialosaccharides. Conformational studies by circular dichroism spectroscopy (CD) revealed no significant influence of the sugar moiety to the well defined secondary structure of the SOC₄-I oligopeptide carrier though confirming the initial design of the SOCn molecules and broadening their applications. The resulted glycopeptide conjugates were used for the development of an ELISA binding assay with influenza pseudoviruses. Preliminary results suggest the usefulness of those glycopeptide conjugates to the diagnosis of influenza infections as well as to receptor specificity studies of different influenza virus isolates.

Η είσοδος του ιού γρίπης στα κύτταρα διαμεσολαβείτε από την ιική γλυκοπρωτεΐνη αιμοσυγκολλητίνη (HA) που συνιστά το κύριο επιφανειακό αντιγόνο έναντι του οποίου κατευθύνονται τα εξουδετερωτικά αντισώματα. Η προτίμηση ιών γρίπης για πρόσδεση στον υποδοχέα σχετίζεται με το είδος από το οποίο οι ιοί αυτοί απομονώνονται. Οι ανθρωπινοί ιοί προσδένονται επιλεκτικά στο τελικό σιαλικό οξύ γλυκοπρωτεϊνών και γλυκολιπιδίων όπου αυτό συνδέεται μέσω α2,6 γλυκοζιτικού δεσμού με γαλακτόζη ενώ οι ιοί των πτηνών προτιμούν α2,3 γλυκοζιτικούς δεσμούς. Με στόχο τη συνεισφορά στην ανάπτυξη εμβολίου έναντι της γρίπης συντέθηκαν συμπλέγματα SOC-CD8 Τ κυτταρικών επίτοπων και ελέγχθηκαν ως προς την ανοσογονικότητά τους σε ποντίκια μετά από πρόκληση μόλυνσης με ιό γρίπης. Οι Τ επίτοποι της αιμοσυγκολητίνης Η5 του ιού της γρίπης που προβλέφθηκαν με υπολογιστικές μεθόδους προσδέθηκαν στον ολιγοπεπτιδικό φορέα SOC₄-I σε δυο αντίγραφα με σκοπό την ενίσχυση της ανοσογονικότητάς τους. Τα επιθυμητά μακρομόρια διακλαδισμένης αρχιτεκτονικής ελήφθησαν είτε με βήμα-προς-βήμα πεπτιδική σύνθεση σε στερεή φάση (Boc/Bzl στρατηγική) είτε μέσω χημειοεκλεκτικής πρόσδεσης σε μια αντίδραση σχηματισμού δεσμού οξίμης μεταξύ κατάλληλα τροποποιημένων πεπτιδικών τμημάτων. Η ανοσολογική απόκριση που προκάλεσε σε ποντίκια η ανοσοποίηση με αυτά τα SOC-συμπλέγματα δεν ήταν ικανοποιητική ώστε να επάγουν προστατευτική ανοσία έναντι της γρίπης. Επιπλέον, με στόχο τη συμβολή στην ανάπτυξη εξειδικευμένων και ευαίσθητων βιολογικών δοκιμασιών για τη διάγνωση και διάκριση μεταξύ ιών γρίπης ανθρώπων και πτηνών συντέθηκαν γλυκοπεπτιδικά ανάλογα ως μιμητικά του υποδοχέα της αιμοσυγκολλητίνης στο ξενιστικό κύτταρο. Η σύνθεση αυτών των αναλόγων επετεύχθη μέσω αντίδρασης χημειοεκλεκτικής πρόσδεσης που οδηγεί στη δημιουργία δεσμού όξιμης μεταξύ του Νε-αμινοοξυακετυλιωμένου φορέα SOC₄-I και της καρβονυλικής ομάδας στο αναγωγικό άκρο διαφόρων σιαλοσακχαριτών. Διαμορφωτικές μελέτες με φασματοσκοπία κυκλικού διχρωϊσμού απέδειξαν ότι η πρόσδεση σακχάρων δεν επηρεάζει την κανονική δευτεροταγή δομή του φορέα SOC₄-I επιβεβαιώνοντας έτσι τον αρχικό σχεδιασμό αυτής της κατηγορίας μορίων-φορέων και διευρύνοντας τις εφαρμογές τους. Τα γλυκοπεπτιδικά μοντέλα του υποδοχέα χρησιμοποιούνται στην ανάπτυξη μιας μεθοδολογίας ELISA για την ανίχνευση και τη μελέτη εξειδίκευσης για υποδοχέα ιών γρίπης τεχνική που αναμένεται να συμβάλλει ουσιαστικά προς την κατεύθυνση νέων διαγνωστικών εργαλείων του ιού της γρίπης των πτηνών.