Εφαρμογή βιοτεχνολογικών μεθόδων στο φυτό ιξός (viscum album L.) για την παραγωγή αντικαρκινικών ουσιών

Abstract

In an attempt to define the optimal conditions for mistletoe (Viscum album) callus culture, somatic embryogenesis and protoplast isolation, we studied the effects of different plant parts (stems and leaves), harvest time (winter or summer), explant disinfection methods, growth regulators, culture medium composition and cell wall digestion treatments. Explants derived from the winter mistletoe accessions responded to the applied culture conditions and maximum callus fresh weight was obtained on a combination of 1mg/lt NAA (Murashige and Skoog). The addition of 10 mg l-1 ascorbic acid considerably improved callus induction and growth and was associated with the formation of embryogenic, pink-whitish callus tissues.The addition of ascorbic acid to the culture medium generally promoted macro and micronutrient accumulation. The evaluation of protein concentration was according to Bearden method and the SDS-PAGE electrophoresis according to Laemmli, using a 10% poly-acrylamide discontinuous gel. It was proven that the average range of the concentrated protein per callus was 1.178 + 0.058 μg/g f.w. (fresh weight). Electrophoresis showed 5 standard proteins of 53, 76, 116 και 170 kDa. The same proteins appeared also to be in donor plants plus one more at: 212 kDa.. Somaclonal variation in the qualitative aspect was 8%. 5 more proteins: 2 of them were smaller than 53 kDa, one was at 100 kDa and one at 150 Da appeared. Boassay experiments were done for the comparison and the verification of the action and the properties between the donor plants’ proteins and the somaclonal calli ‘s proteins. They were tested for their toxicity in three normal cell lines and in two cancer cell lines. More bioassays were took part for the verification of action of proteins in cell function as concerning F.R.O. (Free radicals of oxygen), mitochondrial function, mitochondrial isolation (measurements of mitochondrial potential membranes, cellular oxidase C) in VERO normal cell line and in PC12 cancer cell line. Finally, the results of this study, prescribe, for the first time, a whole approach for the tissue culture of Viscum album and for the standardization of cell factors in order to produce lectins and other products (mainly proteins) for anticancer use. Specially, the standardization of the production of protein (lectins and other) from somaclonal callus, is a special opportunity for the scientific society to study.

Η συγκεκριμένη διδακτορική διατριβή εξέτασε πρωτότυπα την αναπαραγωγή μέσω ιστοκαλλιέργειας του φυτού ιξός (Viscum album, Loranthaceae). Στόχος ο καθορισμός πρωτοκόλλων ιστοκαλλιέργειας του φυτού κι η παραγωγή αντικαρκινικών ουσιών.Μελετήθηκε η χρονική περίοδος βλάστησης του φυτού, το έκφυτο, η φωτοπερίοδος. Ακολούθησαν πειράματα για την εύρεση του καλύτερου θρεπτικού υποστρώματος, έγινε προσθήκη 10% και 20% ασκορβικού οξέος και εκχυλισμάτων που περιείχαν ημι/κυτταρίνες, , λιγνίνες, Alt-4, ή που προέρχονταν από τους ξενιστές του ιξού (π.χ. έλατο). Μετρήθηκαν το ποσοστό καλογένεσης, το Νωπό και Ξηρό Βάρος, έγιναν μακροσκοπικές παρατηρήσεις του κάλου. Το καλύτερο υπόστρωμα προέκυψε με την προσθήκη 10% ασκ. οξέος και 1 mg/lt NAA (Murashige and Skoog) σε έκφυτα βλαστού, χειμερινής περιόδου, με αρχική έκθεση και αυξημένη διάρκεια επώασης στο φως. Μελετήθηκε η συσσώρευση μακρο και μικρο στοιχείων σε σχέση με το είδος του εκφύτου, τον χρόνο επώασης, την προσθήκη ασκορβικού οξέος, και την συγκέντρωση της συνολικής πρωτεΐνης.Από τα αποτελέσματα προκύπτει ότι η συσσώρευση των στοιχείων εξαρτάται από το είδος του εκφύτου (φύλλο, βλαστός), ενώ η προσθήκη 10% ασκορβικού οξέος ευνόησε την μεγαλύτερη συσσώρευση σχεδόν όλων των στοιχείων. Μετρήθηκαν ολικά φαινολικά, κι έγινε απομόνωση πρωτοπλαστών σε κάλους και έκφυτα, ώστε να μελετηθεί η βιωσιμότητα των πρωτοπλαστών.Προσδιορίστηκαν ποσοτικά και ποιοτικά οι παραγόμενες από τον κάλο πρωτεΐνες και συγκρίθηκαν με αυτές που προέρχονταν από τα έκφυτα.Ο ποσοτικός προσδιορισμός των πρωτεϊνών (Bearden) έδειξε παρόμοια συγκέντρωση πρωτεΐνης ανά κάλο(1.178+0.058 μg/g Ν. Β.) και ανά αρχικό φυτό δότη (1.318+ 0.18 μg/g Ν. Β.).Ο ποιοτικός προσδιορισμός (ηλεκτροφορήσεις) των πρωτεϊνών, έδειξε 5 βασικές μπάντες, ίδιες τόσο για το αρχικό φυτό όσο και για τους κάλους (53, 76, 116, 170 και 212 kDa) καθώς και την παραγωγή σωμακλωνικών κάλων. Το ποσοστό αυτών των κάλων, μετρήθηκε σε ποσοστό 8%. Στον σωμακλωνικό κάλο παρατηρούνται 5 επιπλέον μπάντες πρωτεϊνών (146, 96, 47, 35 και 33 kDa).Στις βιοδοκιμές μελετήθηκε η τοξικότητα των εκχυλισμάτων σε διάφορες σειρές φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων έγιναν βιοδοκιμές ελευθέρων ριζών, μεμβρανικού δυναμικού κυττάρων, κυτταρικής οξειδάσης C, μεμβρανικού δυναμικού μιτοχονδρίων. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης περιγράφουν την πρώτη ολοκληρωμένη προσέγγιση της ιστοκαλλιέργειας του Viscum album και της δυνατότητας δημιουργίας κυτταρικών εργοστασίων για την παραγωγή λεκτινών και άλλων ουσιών με αντικαρκινικές ιδιότητες.