Ο ρόλος της ιστόνης macroH2A στη ρύθμιση των γονιδίων που επάγονται μετά από ιϊκή μόλυνση

Abstract

The expression of the appropriate genes in the appropriate spatiotemporal pattern is of crucial importance for all living organisms. In eukaryotes, gene expression is regulated by several factors, acting either in combination or independently. One of the most specialized mechanisms is the dynamic modification of chromatin architecture. This is carried out by several means, one of which is histone variant exchange. MacroH2A is an unusual H2A variant, considered to be implicated in transcriptional repression, due to its inhibitory structure and genomic distribution. Recently the crucial role of macroH2A1 in determining the cell-specific repression of the IL-8 gene transcriptional activation in NAMALWA cells was shown. Triggered by the aforementioned facts, the aim of this work was the identification of the global battery of genes whose expression is regulated by macroH2A1 in distinct cell types, the identification of distinct spatiotemporal programs of virus inducible gene expression and most importantly the investigation of a potential global role of macroH2A1 in the epigenetic determination of cell-specific inducible or not gene expression programs. To accomplish that, novel, stable cell lines of both HeLa and NAMALWA cells have been established, in which macroH2A is either stably knocked-down by the cellular RNAi pathway, via the use of lentivirus-based technologies, or recombinant macroH2A1 is stably over-expressed. Global gene expression of the cell populations prior and upon Sendai virus induction was analyzed with Affymetrix whole human genome expression arrays. After the extensive and strict analysis of the microarray data, the identified genes were annotated and the gene lists were compared, in order to produce biological conclusions. The analysis revealed the total number of genes that are repressed by macroΗ2Α1, the total number of virus inducible genes and the total number of genes whose virus inducible expression is regulated by macroH2A1, in both cell lines HeLa and NAMALWA. The appropriate comparisons revealed at first that virus infection reprograms the host genome, inducing wide alterations in gene expression. Apart from the identification of a small anti-viral core of genes, it is obvious that different cell types respond differently to the same stimulus, by activating distinct sets of genes, at different induction levels and with different activating kinetics. Most importantly, the study showed that macro H2A1 has a crucial role in orchestrating those tissue-specific activation patterns, by regulating the inducible expression of different sets of genes, with different biological functions. It is clearly indicated that macroH2A1 has a much wider and more crucial regulatory role in NAMALWA B-cells than in epithelial HeLas. This is corroborated by the fact that knockdown of macroH2A1 induces apoptosis only in NAMALWA cells. The combinatory study of the microarray data, the verifying RT-PCRs and macroH2A1 ChIP results, provides a series of evidence supporting a cell-specific role of macroH2A1 as an epigenetic regulator of global gene expression and thus a part of the complicated mechanisms determining the establishment of distinct cell types in multicellular organisms.

Η αρχιτεκτονική της χρωματίνης αποτελεί ένα κρισιμότατο παράγοντα ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης και ένας από τους μέχρι στιγμής γνωστούς μηχανισμούς τροποποίησης της είναι η ανταλλαγή ιστονικών ποικιλομορφών. Η macroH2A είναι μια ασυνήθιστη ποικιλομορφή της κανονικής Η2Α, η οποία φαίνεται να έχει σημαντικό ρόλο στην καταστολή της γονιδιακής έκφρασης. Πρόσφατα αποδείχτηκε ο καθοριστικός ρόλος της macroH2A1 στο μηχανισμό ρύθμισης της ιστό-ειδικής επαγωγικής ενεργοποίησης του γονιδίου IL8, αλλά και στη ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου hsp70. Με έναυσμα τα παραπάνω δεδομένα, σκοπός της διδακτορικής αυτής διατριβής ήταν η ταυτοποίηση του συνόλου των γονιδίων, η έκφραση των οποίων ρυθμίζεται από τη macroH2A1, ο προσδιορισμός των διαφορετικών χώρο-χρονικών προγραμμάτων γονιδιακής επαγωγής σε απόκριση στην ιϊκή μόλυνση και κυρίως η διερεύνηση ενός πιθανού ευρύτερου ρόλου της macroH2A1 στον επιγενετικό καθορισμό ιστό-ειδικών προγραμμάτων συνεχούς ή επαγόμενης από ιό γονιδιακής έκφρασης. Κάνοντας χρήση του κυτταρικού μονοπατιού παρεμπόδισης του RNA με κατάλληλα τροποποιημένους λέντι-ιούς, δημιουργήθηκαν νέες σταθερές κυτταρικές σειρές επιθηλιακών κυττάρων HeLa και Β-λεμφοκυττάρων NAMALWA με σχεδόν εκμηδενισμένη έκφραση του γονιδίου της macroH2A1 και άλλες με σταθερή υπέρ-έκφραση ανασυνδυασμένης macroH2A1. Ακολούθησε η ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης όλων των κυτταρικών πληθυσμών, πριν και μετά από επαγωγή με ιό Sendai, με ολιγονουκλεοτιδικές μικροσυστοιχίες έκφρασης της Affymetrix. Ύστερα από την εξαντλητική και αυστηρή στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων των μικροσυστοιχιών, πραγματοποιήθηκε ο λεπτομερής χαρακτηρισμός των προσδιορισμένων γονιδίων και η αντιστοίχιση τους σε κυτταρικές διεργασίες και μονοπάτια. Με τη στρατηγική αυτή, προσδιορίστηκαν και στους δυο κυτταρικούς τύπους το σύνολο των γονιδίων, η έκφραση των οποίων ρυθμίζεται από τη macroH2A1, το σύνολο των γονιδίων που επάγονται μετά από μόλυνση με ιό και τέλος το σύνολο των γονιδίων που η επαγωγή τους μετά από μόλυνση με ιό ρυθμίζεται από την macroH2A1. Από τις κατάλληλες συγκρίσεις των γονιδιακών λιστών προέκυψε μια σειρά από άκρως ενδιαφέροντα βιολογικά συμπεράσματα. Φάνηκε ότι η ιϊκή μόλυνση επαναπρογραμματίζει το γονιδίωμα του ξενιστή, προξενώντας μεγάλες μεταβολές στην έκφραση των γονιδίων. Πέραν των μικρών ομοιοτήτων και του προσδιορισμού ενός κοινού αντί-ιικού πυρήνα γονιδίων, κατέστη προφανές το γεγονός ότι διαφορετικοί τύποι κυττάρων ανταποκρίνονται διαφορετικά στην ιική μόλυνση, ενεργοποιώντας διαφορετικές ομάδες γονιδίων, με διαφορετικά επίπεδα επαγωγής και διαφορετική κινητική επαγωγικής ενεργοποίησης. Η έρευνα αυτή αποκάλυψε πως η macroH2A1 είναι υπεύθυνη για τον καθορισμό ενός μεγάλου μέρους της γονιδιακής απόκρισης στην ιϊκή μόλυνση και στους δυο κυτταρικούς τύπους, με άκρως ιστό-εδικό πρότυπο, καθώς ρυθμίζει την επαγόμενη έκφραση διαφορετικών σετ γονιδίων, με διαφορετικές βιολογικές λειτουργίες. Ο ρυθμιστικός ρόλος της macroH2A1 είναι ευρύτερος στα B-λεμφοκύτταρα από ότι στα επιθηλιακά HeLa, αλλά και πιο ζωτικός, καθώς η μείωση της ποσότητας της επάγει την απόπτωση στα NAMALWA, κάτι που εμπλέκει τη macroH2A1 στην κυτταρική διαφοροποίηση και στον καθορισμό της λειτουργίας των διαφορετικών κυτταρικών τύπων. Τέλος, η επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων με αντιδράσεις RT-PCR και η πραγματοποίηση πειραμάτων ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης ανέδειξαν τη macroH2A1 ως ένα ουσιαστικό τμήμα ευρύτερων μηχανισμών λεπτής ρύθμισης της γονιδιακής ενεργοποίησης.