Συντονισμός της γονιδιακής ρύθμισης μετά από ιϊκή μόλυνση

Abstract

The main subject of the present Doctoral Thesis were the regulatory mechanisms that govern gene expression during the antiviral cellular response. In order to achieve this goal an array of modern genomics, molecular biology, biochemistry and computational biology methodologies were implemented. Our main goals were [1] to identify differentially expressed human genes [2] the enhancer elements that regulate those genes and [3] the detailed study of the genomic distribution of master transcription factors that orchestrate the antiviral cellular response. Our experimental system includes two well characterized cell types, HeLa (epithelial-like cells) and Namalwa (B-like cells). As the environmental stimulus of Virus infection we used Sendai Virus that was added to the culture media and experiments were conducted prior and 3 and 6 hours upon infection Initially, we identified differentially expressed genes at the transcriptome-wide level during the antiviral cellular response in Namalwa and HeLa cells. An antiviral core of approximately 200 genes was induced in both cell types, enriched for immune processes such as the interferon pathway and the response to cytokines. In order to identify the accessible part of the genome and its reconfiguration during the antiviral cellular response, FAIRE-seq and DNaseI-seq methodologies were implemented. This led to the identification of hundreds of regions with Virus inducible chromatin accessibility which are preferentially found in the vicinity of Virus inducible genes according to RNA-seq experiments and bear motifs for master regulators of the immune response such as the IRF family. Next, we studied in detail the genomic redistribution of the immune master regulators IRF3 and p65 ChIP-seq and found an extensive, inducible colocalization of those factors at hundreds of genomic regions, a fact underscoring their potential synergy in regulating the antiviral cellular response. The majority of inducible binding sites were found hosted in chromatin regions that were accessible even prior to infection and carried additional markers characteristic of active enhancers such as CBP and Med1 binding and constitutive H3K27ac levels. Nevertheless, it is important to mention the presence of inducible IRF3 binding sites with or without p65 colocalisation in chromatin regions that were not accessible and did not carry active chromatin marks prior to infection. These regions gain significant accessibility upon infection and inducible binding of the coactivators Med1 and CBP as well as H3K27ac. So, by centering our analyzes around IRF3 we found that inducible gene expression is accompanied in several cases by an increase in chromatin accessibility, inducible binding of IRF3 with or without p65, inducible coactivator binding and inducible H3K27ac levels. Moreover, these regions are preferentially found in the proximity of virus inducible genes and bear motifs for crucial regulators such as IRF and Jun/Fos, further underscoring their potential role in regulating critical antiviral genes. By using FAIRE-seq, DNaseI-seq and ChIP-seq methodologies putative inducible enhancers were identified based on structural chromatin characteristics such as increased chromatin accessibility and inducible transcription factor binding. Although these markers are correlated with enhancers based on a plethora of studies, their presence does not prove the enhancer activity of the underlying DNA sequence. In order to fill this gap and test the activity of the identified putative enhancers in vivo, we implemented and modified the unique ChIP-STARR-seq methodology, a massive scale reporter assay to simultaneously test the virus inducible enhancer activity of thousands of IRF3 and p65 binding sites. Strikingly, we found that only 10% of the approximately 3000 strongly inducible IRF3 sites are active inducible enhancers. An interesting finding revealed by scanning the DNA sequences of IRF3-STARR-seq enhancers was that many of them contain serial repetitive IRF motifs. According to our knowledge our finding of Virus inducible enhancers that exclusively carry arrays of IRF binding sites has not been described before. By scanning representative genomes spanning the entire course of evolution using a consensus IRF motif derived from repetitive enhancers we discovered that IRF repetitive sequences are a universal characteristic of genomes as they are found in all examined species. Moreover, individual sequences with repetitive elements are found in Viral genomes such as those of Herpes Viruses.

Η παρούσα Διδακτορική Διατριβή είχε ως αντικείμενο μελέτης τους μηχανισμούς γονιδιακής έκφρασης που διέπουν την απόκριση των ανθρώπινων κυττάρων κατά τη διάρκεια Ιικών μολύνσεων. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε κατά μόνας ή σε συνδυασμό ο πλέον σύγχρονος και πρωτοποριακός τρόπος εφαρμογής των τεχνικών της γονιδιωματικής, μοριακής βιολογίας, βιοχημείας και υπολογιστικής βιολογίας. Κύριοι στόχοι ήταν η μελέτη σε επίπεδο ολόκληρου του γονιδιώματος και του μεταγραφόματος των μοριακών γεγονότων που συμβαίνουν σε ανθρώπινα κύτταρα κατά τη διάρκεια Ιικών μολύνσεων. Πιο συγκεκριμένα [1] η καταγραφή των ανθρώπινων γονιδίων των οποίων η έκφραση μεταβάλλεται, [2] η ταυτοποίηση των ενισχυτών του DNA που ρυθμίζουν την έκφραση αυτών των γονιδίων καθώς και [3] η ενδελεχής μελέτη των μεταγραφικών παραγόντων που ρυθμίζουν το συντονισμό του φαινομένου της αντιϊκής κυτταρικής λειτουργίας. Το βασικό σύστημα μελέτης αποτέλεσαν οι δυο καλά χαρακτηρισμένοι κυτταρικοί τύποι HeLa (επιθηλιακά κύτταρα) και Namalwa (Β-λεμφοκύτταρα) και ως περιβαλλοντικό ερέθισμα της Ιϊκής μόλυνσης χορηγήθηκε ϊός Sendai στο θρεπτικό μέσο των κυττάρων. Αρχικά, μελετήσαμε τις αλλαγές στο μεταγραφικό προφίλ όλων των γονιδίων που μεταβάλουν την έκφρασή τους κατά τη κυτταρική αντιϊκή απόκριση σε Namalwa και HeLa κύτταρα. Εντοπίστηκε ένας πυρήνας περίπου 200 γονιδίων που επάγονται και στους δύο κυτταρικούς τύπους και σχετίζονται με ανοσολογικές λειτουργίες όπως το μονοπάτι των ιντερφερονών και η απόκριση σε κυτοκίνες. Στη συνέχεια με τις τεχνικές FAIRE-seq και DNaseI-seq εντοπίσαμε τις προσβάσιμες περιοχές στο γονιδίωμα και τις μεταβολές στη προσβασιμότητά τους κατά την εξέλιξη της αντιϊκής απόκρισης. Εντοπίστηκαν εκατοντάδες περιοχές με αυξημένη προσβασιμότητα κατά τη διάρκεια της αντιϊκής απόκρισης, οι οποίες είχαν τη τάση να βρίσκονται κοντά σε ιϊκά επαγόμενα γονίδια σύμφωνα με τα πειράματα RNA-seq και να φέρουν μοτίβα για σημαντικούς ρυθμιστές της αντιϊκής απόκρισης όπως οι παράγοντες IRF. Έπειτα για να μελετήσουμε το πρότυπο πρόσδεσης δύο καίριων μεταγραφικών παραγόντων για την αντιϊκή απόκριση, του IRF3 και του p65 πραγματοποιήσαμε πειράματα ChIP-seq από τα οποία διαπιστώθηκε ο ιϊκά επαγόμενος συνεντοπισμός των δύο παραγόντων σε εκατοντάδες περιοχές στο γονιδίωμα, γεγονός που υποδηλώνει πιθανή συνέργεια των δύο παραγόντων στη ρύθμιση της αντιϊκής απόκρισης. Η πλειοψηφία των επαγόμενων θέσεων πρόσδεσης για τους παράγοντες IRF3 και p65 εδράζει σε περιοχές χρωματίνης που ήταν προσβάσιμες ήδη πριν από την ιϊκή μόλυνση και έφεραν επιπλέον χαρακτηριστικά των ενεργών ενισχυτών όπως πρόσδεση των συνενεργοποιητών CBP, Med1 καθώς και παρουσία της ιστονικής τροποποίησης H3K27ac. Παρόλα αυτά αξίζει να τονιστεί ιδιαίτερα η ύπαρξη περιοχών επαγόμενης πρόσδεσης του IRF3 με ή χωρίς το p65 σε περιοχές της χρωματίνης που είναι μη προσβάσιμες πριν από τη ιϊκή μόλυνση και οι οποίες επιπλέον δεν φέρουν χαρακτηριστικούς δείκτες όπως CBP, Med1 και H3K27ac. Στις περιοχές αυτές όμως παρατηρείται αύξηση της προσβασιμότητας της χρωματίνης και επαγόμενος συνεντοπισμός των παραπάνω δεικτών μετά την ιϊκή μόλυνση. Επιπλέον οι αλληλουχίες αυτές έχουν τη τάση να βρίσκονται κοντά σε ιϊκά επάγομενα γονίδια και να φέρουν μοτίβα για ρυθμιστές της αντιϊκής απόκρισης όπως οι παράγοντες IRFκαι Jun/Fos, γεγονός που ενισχύει περαιτέρω τη πιθανότητα να ρυθμίζουν κρίσιμα αντιϊκά γονίδια. Με τις τεχνικές FAIRE-seq, DNaseI-seq και ChIP-seq εντοπίστηκαν πιθανοί επαγόμενοι ενισχυτές με βάση αλλαγές σε δομικά χαρακτηριστικά της χρωματίνης όπως η αύξηση στη προσβασιμότητα της χρωματίνης και η πρόσδεση μεταγραφικών παραγόντων. Παρόλο που οι συγκεκριμένοι δείκτες σύμφωνα και με τη βιβλιογραφία χαρακτηρίζουν τους ενισχυτές, δεν αποδεικνύουν την ενεργότητά τους. Για να καλύψουμε αυτό το κενό και να μπορέσουμε να ελέγξουμε την ενεργότητα των πιθανών ενισχυτών που ανιχνεύσαμε in vivo, εφαρμόσαμε και τροποποιήσαμε τη πρωτοποριακή τεχνική ChIP-STARR-seq, μια ευρείας κλίμακας δοκιμασία αναφοράς (reporter assay) με την οποία εξετάσαμε ταυτόχρονα και μαζικά την ιϊκά επαγόμενη ενεργότητα των χιλιάδων περιοχών πρόσδεσης των μεταγραφικών ρυθμιστών της αντιϊκής απόκρισης IRF3 και p65. Το πολύ ενδιαφέρον εύρημα είναι ότι μόνο ένα ποσοστό περίπου 10% από τις περίπου 3000 αλληλουχίες με ισχυρή πρόσδεση του IRF3 λειτουργούν ως ενεργοί επαγόμενοι ενισχυτές. Από τη μελέτη των αλληλουχιών DNA των επαγόμενων ενισχυτών που προέκυψαν από τη μέθοδο STARR-seq διαπιστώθηκε ότι ένας σημαντικός αριθμός από αυτούς φέρουν στη σειρά επαναλαμβανόμενα μοτίβα πρόσδεσης των παραγόντων IRF. Πραγματοποιώντας σάρωση γονιδιωμάτων από διαφορετικά είδη χρησιμοποιώντας το consensus IRF μοτίβο, που αποτελεί τη δομική μονάδα των επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών διαπιστώθηκε ότι οι επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες εντοπίζονται σε όλους τους οργανισμούς που εξετάστηκαν. Επιπλέον μεμονωμένες αλληλουχίες με επαναλαμβανόμενα μοτίβα IRF εντοπίζονται και στα γονιδιώματα διαφόρων ιών όπως οι ερπητοϊοί.