Ανάπτυξη και εφαρμογή μοριακών διαγνωστικών μεθόδων για αναγνώριση ποικιλιών και βελτίωση στο βαμβάκι

Abstract

We used SSRs markers for the identification and the phylogenetic analysis of a number of cotton varieties that are cultivated in Greece. Initially, we used 12 pairs of SSR molecular markers for the analysis of 29 varieties of G. hirsutum and an interspecific hybrid (G.hirsutum x G.barbadense). From the 12 pairs of SSRs the eleven (91.6%) amplified polymorphic products, while a pair did not amplify any product. Globally were amplified 17 polymorphic marker loci. In each genomic loci there were amplified 2 to 5 different alleles with a mean of 2.53. The index Polymorphism Information (PIC) for the 30 varieties that were analyzed ranged from 0 to 0.548 with an average 0,293. Three main groups were formed when the phylogenetic analysis was performed with UPGMA for the 30 varieties of cotton that were used in our experiments. Computational analysis of each molecular marker separately showed correlation with agronomic traits, controlling fiber quality as these have been studied by the Institute of Cotton (experiments 2002-2003). Furthermore, for the recognition of cotton varieties with SSR molecular markers it was also used a new approach named high resolution melting curve analysis (HRM). With this method and using SSR molecular markers 29 cotton varieties were analyzed and which could be recognized by their melting curves. The actin-binding protein profilin plays an important role in cell growth and expansion by regulating the organization of the actin filaments. Recent studies have reported association between cotton fiber cell elongation and profilin expression. Southern blot hybridization suggested that profilin is present with more than one copy in the allotetraploid species G. hirsutum. Expression analysis performed in various cotton organs revealed that the profilin gene was preferentially expressed in cotton fibers. Very low levels of expression were observed in whole flowers, while profilin transcripts were absent from the other organs, which were examined. In addition, higher levels of expression where observed at the early stages of cotton fiber development (at 10 days post anthesis), suggesting that this gene may play a major role in the cotton fiber elongation stage. Quantitation of expression using real-time PCR revealed higher expression levels in a G. hirsutum variety with higher fiber percentage than a variety with lower percentage. Furthermore, higher expression levels were found in another cultivated allotetraploid cotton species, G. barbadense with higher fiber length in comparison to G. hirsutum.

Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η ανάπτυξη και η χρήση νέων μοριακών διαγνωστικών μεθόδων για την αναγνώριση ποικιλιών και την βελτίωση στο βαμβάκι. Στα πλαίσια της έρευνας αυτής με τη χρήση των δεικτών SSRs πραγματοποιήθηκε προσπάθεια για την αναγνώριση και τη φυλογενετική ανάλυση ποικιλιών βαμβακιού που καλλιεργούνται στην Ελλάδα. Αρχικά χρησιμοποιήθηκαν 12 ζεύγη SSR μοριακών δεικτών για την ανάλυση 29 ποικιλιών του είδους G. hirsutum και ενός διαειδικού υβριδίου (G.hirsutum x G.barbadense). Από τα 12 ζεύγη των SSRs τα έντεκα (91,6 %) ενίσχυσαν πολυμορφικά προϊόντα, ενώ το ένα ζεύγος δεν ενίσχυσε καθόλου προϊόν. Συνολικά ενισχύθηκαν 17 πολυμορφικές γονιδιωματικές περιοχές. Σε κάθε γονιδιωματική περιοχή ενισχύθηκαν από 2 έως 5 διαφορετικά αλληλόμορφα, ενώ η μέση τιμή ήταν 2,53. Η περιεχόμενη πληροφορία πολυμορφισμού (PIC) για τις 30 ποικιλίες που αναλύθηκαν είχε εύρος τιμών από 0 έως 0,548, με μέσο όρο 0,293. Η φυλογενετική ανάλυση με τη μέθοδο UPGMA έδειξε ότι οι 30 ποικιλίες βαμβακιού που χρησιμοποιήθηκαν δημιουργούν τρεις κύριες ομάδες. Η ανάλυση με το στατιστικό πρόγραμμα SPSS 15.0 κάθε μοριακού δείκτη χωριστά φανέρωσε πιθανή συσχέτιση τους με αγρονομικά χαρακτηριστικά της ίνας, όπως αυτά έχουν μελετηθεί από το Ινστιτούτο Βάμβακος (Πειράματα 2002-2003). Επίσης για την αναγνώριση των ποικιλιών στο βαμβάκι με τους SSR μοριακούς δείκτες χρησιμοποιήθηκε και μια νέα προσέγγιση, η υψηλής διακριτικής ικανότητας ανάλυση καμπυλών τήξης (HRM). Με τη μέθοδο της HRM και με την χρήση SSR μοριακών δεικτών αναλύθηκε ένας αριθμός από ποικιλίες βαμβακιού που ήταν δυνατό να αναγνωρισθούν από τις καμπύλες τήξεως. Η προφιλίνη, μία πρωτεΐνη δέσμευσης της ακτίνης, διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και τη διόγκωση των κυττάρων ρυθμίζοντας την οργάνωση των ινών της ακτίνης. Πρόσφατες έρευνες αναφέρουν συσχέτιση μεταξύ της επιμήκυνσης των κυττάρων της ίνας του βαμβακιού και της έκφρασης της προφιλίνης. Από τον υβριδισμό στυπώματος κατά Southern προέκυψε ότι η προφιλίνη κωδικοποιείται από περισσότερα του ενός αντίγραφα στο αλλοτετραπλοειδές G. hirsutum. Με την ανάλυση της έκφρασης που πραγματοποιήθηκε σε διάφορους ιστούς βρέθηκε ότι η προφιλίνη εκφράζεται κυρίως στις ίνες του βαμβακιού. Πολύ χαμηλά επίπεδα έκφρασης βρέθηκαν σε ολόκληρο το άνθος, ενώ τα μετάγραφα της προφιλίνης απουσίαζαν από όλα τα άλλα όργανα που μελετήθηκαν. Καταληκτικά, από τα αποτελέσματα και των τριών παραπάνω μελετών προκύπτει ότι οι SSR μοριακοί δείκτες μπορούν να αξιοποιηθούν για την αναγνώριση ποικιλιών του βαμβακιού, ενώ η χρήση της μεθόδου HRM συμβάλει στην ταχεία και ακριβή αναγνώρισή τους. Επιπλέον η εύρεση της φυλογενετικής συγγένειας των ποικιλιών με τη χρήση των SSR μοριακών δεικτών καθώς και η συσχέτιση αυτών με ποιοτικά χαρακτηριστικά της ίνας του βαμβακιού μπορεί να αξιοποιηθεί στα βελτιωτικά προγράμματα του βαμβακιού. Τέλος, συμπεραίνεται ότι το γονίδιο της προφιλίνης είναι ένας θετικός ρυθμιστής της επιμήκυνσης των ινών του βαμβακιού και της πυκνότητας των ινών.