Σύνθεση, δομικός χαρακτηρισμός και ιδιότητες ειδικώς τροποποιημένων κυκλοδεξτρινών: μελέτες μοριακού εγκλεισμού αντιμικροβιακών και άλλων φαρμάκων

Abstract

Antibiotics are drugs that inhibit via specific mechanisms the multiplication of bacteria that infect organisms. Development of resistance to antibiotics is one of the major problems encountered in the treatment of microbial infections. The current thesis aims to contribute with new substances in the treatment of microbial infections. The new substances are based on natural cyclodextrins (CDs). The CDs are water soluble cyclic oligomers of glucose with hydrophilic exterior and hydrophobic cavity that can encapsulate a variety of molecules. The natural CDs and some simple derivatives are already approved drug carriers. Microbes adhere to the tissues of the host organism through complex mechanisms that include recognition by microbial lectins of the sugars found on the surface of epithelial cells. The interaction between lectins and carbohydrates is based on molecular recognition, of specific sugars from specific lectins. This and many other biological recognition processes rely on the multivalency effect, which is responsible for enhancement of weak interactions. CD derivatives with sugars (glycoclusters) were synthesised, which can combine (a) presence of a cavity for drug delivery and inclusion (b) suitable recognition sugars for targeting microbial lectins (c) increased ability to interact with lectins due to numerous sugars on a cyclodextrin (multivalency effect). These substances are hepta-, octa-, dodeca-, tetradeca- and hexadeca- substituted derivatives of α-, β- and γ- cyclodextrin, connected via short linkers with the sugars D-(+)- mannose (Man), D-(+)-galactose (Gal), D-(+)-glucose (Glc), L-(-)-fucose (Fuc), Nacetyl- D-glucosamine (GlcNAc), N-acetyl-D-galactosamine (GalNAc). Thus, 19 new glycoclusters were synthesized and identified by detailed analysis of their NMR and MS spectra. For the synthesis of glycoclusters the natural cyclodextrins were modified either to known carboxy and amino- substituted derivatives or to new EDTA-type compounds, i.e. to hexakis-, heptakis- and octakis- [bis(carboxymethyl)amino] cyclodextrins. The EDTA-CDs showed excellent properties in terms of binding lanthanide and other metal cations. These CDs were coupled with suitably modified sugars via amide linkages. For the modification of sugars literature methods were adopted with several alterations and improvements. White Light Reflectance Spectroscopy (WLRS) experiments showed that the glycoclusters interact stronger with selected lectins when they bear more than one recognition sugar (multivalency effect). The binding constant K, was found to range between 104 Μ-1 and ~106 Μ-1, depending on the glycocluster. In addition in vitro experiments using glycoclusters labeled with a fluorescent molecule and incubated with two selected microbial strains Aeromonas caviae (ATCC 15468) and Ralstonia solanacearum (ATCC 11696), showed by fluorimetry and fluorescence microscopy that the interactions between the bacterial cell wall and the compound of interest are enhanced by increasing the number of sugars. This proves the targeting ability of compounds and the effectiveness of multivalency. In addition, enzymatic hydrolysis experiments of ampicillin in the presence of glycoclusters showed 30% inhibition. Finally, preliminary examination of the effectiveness of ciprofloxacin, levofloxacin and oxolinic acid in the presence of some modified cyclodextrins using a number of hospital microbial strains showed a limited positive effect in the MIC (minimum inhibition concentration) values.

Τα αντιβιοτικά είναι φάρμακα τα οποία μέσω συγκεκριμένων μηχανισμών αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των μικροβίων που μολύνουν τους οργανισμούς. Η ανάπτυξη ανθεκτικότητας των μικροβίων στα αντιβιοτικά είναι ένα από τα σημαντικότερα προβλήματα που έχουν ανακύψει στην θεραπεία των μικροβιακών μολύνσεων. Η παρούσα διατριβή έχει ως σκοπό να συνεισφέρει στην αντιμετώπιση των μικροβιακών μολύνσεων με νέες ουσίες. Οι ουσίες αυτές βασίζονται στις κυκλοδεξτρίνες (CDs), οι οποίες είναι υδατοδιαλυτά κυκλικά ολιγομερή της γλυκόζης. Οι CDs έχουν υδρόφιλο εξωτερικό μέρος και υδρόφοβη κοιλότητα, στην οποία εγκλωβίζουν πληθώρα μορίων, δρουν δηλαδή ως μοριακοί ξενιστές. Οι φυσικές CDs και μερικά απλά παράγωγά τους είναι ήδη εγκεκριμένοι φορείς φαρμάκων. Τα μικρόβια εγκαθίστανται στους ιστούς μέσω πολύπλοκων μηχανισμών που περιλαμβάνουν την αναγνώριση μικροβιακών λεκτινών από σάκχαρα των επιθηλιακών κυττάρων του ξενιστή οργανισμού. Η σύνδεση λεκτινών-σακχάρων βασίζεται στην μοριακή αναγνώριση, συγκεκριμένων σακχάρων από συγκεκριμένες λεκτίνες. Η αλληλεπίδραση αυτή αλλά και πολλές άλλες διαδικασίες αναγνώρισης στον βιολογικό κόσμο ενισχύονται από το φαινόμενο της πολυδυναμικότητας (multivalency), δηλαδή την ενδυνάμωση της σύνδεσης μέσω αύξησης του αριθμού των ασθενών αλληλεπιδράσεων. Οι νέες ουσίες που συντέθηκαν είναι παράγωγα κυκλοδεξτρινών με σάκχαρα (υδατανθρακικά συμπλέγματα, glycoclusters), τα οποία συνδυάζουν (α) παρουσία κοιλότητας για μεταφορά και εγκλεισμό φαρμάκων (β) κατάλληλα σάκχαρα αναγνώρισης για στόχευση μικροβιακών λεκτινών (γ) αυξημένη ικανότητα σύνδεσης με λεκτίνες λόγω ύπαρξης πολλών σακχάρων σε μία κυκλοδεξτρίνη (πολυδυναμικότητα). Οι ουσίες που συντέθηκαν είναι επτα-, οκτα-, δωδεκα-, δεκατετρα- και δεκαεξα– υποκατεστημένα παράγωγα α-, β- και γ- κυκλοδεξτρίνης, συνδεδεμένα μέσω μικρών γεφυρών (linkers) με τα σάκχαρα D-(+)-μαννόζη (Man), D-(+)-γαλακτόζη (Gal), D-(+)-γλυκόζη (Glc), L-(-)-φουκόζη (Fuc), Ν-ακετυλο-D- γλυκοζαμίνη (GlcNAc), Ν-ακετυλο-D-γαλακτοζαμίνη (GalNAc). Προέκυψαν 19 νέα υδατανθρακικά συμπλέγματα, τα οποία ταυτοποιήθηκαν με φασματοσκοπία NMR 1Δ (1H, 13C) και 2Δ (COSY, HSQC, HMBC, ROESY, NOESY) καθώς και φασματομετρία μάζας (MS). Για την σύνθεση των ενώσεων προαπαιτήθηκε τροποποίηση των φυσικών κυκλοδεξτρινών σε καρβόξυ και αμίνο υποκατεστημένα παράγωγα, γνωστά από την βιβλιογραφία, αλλά και σε νέα παράγωγα τύπου EDTA, δηλαδή εξάκις-, επτάκις- και οκτάκις- [δι(καρβοξυμεθυλο)αμινο]κυκλοδεξτρίνες, οι οποίες μάλιστα εμφάνισαν εξαιρετικές ιδιότητες ως προς την δέσμευση λανθανιδών και άλλων μετάλλων. Οι ανωτέρω CDs, συνδέθηκαν με τα τροποποιημένα σάκχαρα μέσω αμιδικών δεσμών. Για την τροποποίηση των σακχάρων ακολουθήθηκαν βιβλιογραφικές μέθοδοι με πολλές βελτιώσεις και τροποποιήσεις. Τα υδατανθρακικά συμπλέγματα, όπως έδειξαν πειράματα με διάταξη φασματοσκοπίας ανάκλασης λευκού φωτός (WLRS), συνδέονται ισχυρότερα με επιλεγμένες λεκτίνες όταν φέρουν πολλά σάκχαρα αναγνώρισης σε σύγκριση με μονο-υποκατεστημένα ανάλογα, επιβεβαιώνοντας την αποτελεσματικότητα της πολυδυναμικότητας. Η ισχύς της σύνδεσης (K) κυμαίνεται μεταξύ 104 Μ-1 και ~106 Μ-1, ανάλογα με τον αριθμό των μονοσακχαριτών που φέρει η CD. Επιπλέον in vitro πειράματα όπου υδατανθρακικά συμπλέγματα επισημασμένα με φθορίζουσα ουσία επωάσθηκαν με δύο επιλεγμένα στελέχη μικροβίων Aeromonas caviae (ATCC 15468) και Ralstonia solanacearum (ATCC 11696), έδειξαν ότι οι ενώσεις προσκολλώνται στα τοιχώματα των βακτηρίων και μάλιστα τόσο περισσότερο, όσο περισσότερα σάκχαρα φέρουν, όπως έδειξαν πειράματα φθορισμομετρίας και μικροσκοπίας φθορισμού. Το γεγονός αυτό αποδεικνύει την ικανότητα στόχευσης (targeting) των ενώσεων και την αποτελεσματικότητα της πολυδυναμικότητας (multivalency). Επιπροσθέτως, πειράματα ενζυμικής υδρόλυσης του αντιβιοτικού αμπικιλλίνη έδειξαν αναστολή υδρόλυσης έως και 30% παρουσία υδατανθρακικών συμπλεγμάτων. Τέλος προκαταρκτική εξέταση της αποτελεσματικότητας παρουσία σιπροφλοξασίνης, λεβοφλοξασίνης και οξολινικού οξέος μερικών από τις τροποποιημένες κυκλοδεξτρίνες σε ικανό αριθμό νοσοκομειακών μικροβιακών στελεχών έδειξε μικρή θετική επίδραση στην MIC (minimum inhibition concentration).