Χαρακτηρισμός μοριακών ανοσολογικών αλληλεπιδράσεων χρησιμοποιώντας βιοαισθητήρες και ολόκληρα κύτταρα

Abstract

Molecular interactions that govern cell?cell interactions are mediated by molecules embedded in the cell membrane, are very common in the immune system and are distinct from interactions between soluble molecules. Assays that can detect these interactions in a non?invasive way are particularly useful. Work was focused towards the development of such assays using biosensors. A well?defined cellular model system was used to study the responses of biosensor systems during the interaction of cell membrane receptors, class I MHC HLA?A2 molecules on the surface of cells, bound to ligands, anti?HLA?A2 monoclonal antibodies, immobilized on the sensor devices. The acoustic biosensor systems used, a Love?wave sensor and a quartz crystal microbalance (QCM) sensor detected the molecular interaction quantitatively but showed different sensitivity to different cell treatments: the QCM sensor detected cytoskeleton perturbations by cytochalasin whereas the Love?wave sensor distinguished cell types on the basis of cell surface HLA densities. For the Love?wave sensor, acoustic energy dissipation was found to correlate directly with the number of cell?membrane receptors specifically attached to immobilized antibodies, which enabled the characterization of the interaction via the calculation of the 2D kinetic and affinity parameters. Also, the dependence of cell adhesion on glycocalyx condition was demonstrated for HLA/anti?HLA binding. In order to move towards the characterization of a more biologically significant interaction pair, membrane models on biosensor surfaces were developed for the attachment of proteins of interest. Two types of lipid membranes were prepared, lipid monolayers on self?assembled thiol layers and lipid bilayers on hydrophilic silica surfaces. A real?time biosensing technique to study the binding of T cells to a pMHC?modified surface was proposed. As a TCR system, the JM22 TCR, which recognizes the influenza matrix peptide MP(58?66) presented on HLA?A2, was selected. The biosensor surface was prepared using a lipid monolayer presenting HLA?A2/MP(58?66) complexes. Two T cell systems were prepared for the biosensor technique, a cell line transfected with JM22 TCR and primary T cell clones isolated from peripheral blood. These cells were characterized for TCR expression and cytotoxicity. The long?term goal is to measure the 2D binding parameters of the TCR?pMHC interaction and correlate these with the physiological response of cells to antigen recognition.

Οι μοριακές αλληλεπιδράσεις που καθορίζουν τις αλληλεπιδράσεις κυττάρου/κυττάρου μεσολαβούνται από μόρια ενσωματωμένα στην κυτταρική μεμβράνη, είναι άφθονες στο ανοσοποιητικό σύστημα και είναι διαφορετικές από ότι ανάμεσα σε διαλυτά μόρια. Εστίαση έγινε στην ανάπτυξη τεχνικών μελέτης τέτοιων αλληλεπιδράσεων χρησιμοποιώντας βιοαισθητήρες. Ένα καλά ορισμένο μοντέλο κυτταρικό σύστημα χρησιμοποιήθηκε για τη μελέτη των αποκρίσεων βιοαισθητήρων κατά την αλληλεπίδραση μεμβρανικών υποδοχέων, τάξης Ι MHC μορίων HLA?A2 στην επιφάνεια κυττάρων, με προσδέτες τους, μονοκλωνικά αντισώματα ειδικά έναντι του HLA?A2, ακινητοποιημένους στην επιφάνεια των αισθητήρων. Οι βιοαισθητήρες που χρησιμοποιήθηκαν, ένας αισθητήρας τύπου Love και ένας αισθητήρας?μικροζυγός κρυσταλλικού χαλαζία (QCM), ανίχνευσαν ποσοτικά τη μοριακή αλληλεπίδραση. Επίσης, εμφάνισαν διαφορετική ευαισθησία σε διαφορετικούς χειρισμούς των κυττάρων, όπως διατάραξη του κυτταροσκελετού από κυτοχαλασίνη (στον QCM), ή διαχωρισμός των κυτταρικών τύπων με βάση την επιφανειακή πυκνότητα των HLA μορίων (στον αισθητήρα Love). Για τον αισθητήρα Love, η απώλεια ενέργειας του ακουστικού κύματος έδειξε γραμμική συσχέτιση με τον αριθμό των μεμβρανικών υποδοχέων που προσδένονται ειδικά στα ακινητοποιημένα αντισώματα και χρησιμοποιήθηκε για το χαρακτηρισμό της αλληλεπίδρασης υπολογίζοντας τις κινητικές παραμέτρους και τη συγγένεια σε 2D. Επιπλέον, φανερώθηκε η εξάρτηση της κυτταρικής προσκόλλησης από την κατάσταση του γλυκοκάλυκα των κυττάρων. Για τη μετάβαση σε ένα περισσότερο βιολογικά σημαντικό ζεύγος αλληλεπίδρασης, αναπτύχθηκαν μοντέλα μεμβρανών σε επιφάνειες βιοαισθητήρων για την πρόσδεση πρωτεϊνών ενδιαφέροντος. Δυο τύποι λιπιδικών μεμβρανών προετοιμάστηκαν, λιπιδικές μονοστοιβάδες σε μονοστοιβάδες θειολών και λιπιδικές διπλοστοιβάδες σε υδρόφιλες επιφάνειες silica. Επίσης, προτάθηκε μια τεχνική βιοαισθητήρα για τη μελέτη της πρόσδεσης Τ κυττάρων σε επιφάνεια με pMHCs. Ως σύστημα TCR, επιλέχθηκε o JM22 TCR, ο οποίος αναγνωρίζει το πεπτίδιο MP(58?66) από τον ιό της γρίπης παρουσιασμένο στο HLA?A2. Η επιφάνεια του βιοαισθητήρα προετοιμάστηκε με λιπιδική μονοστοιβάδα που παρουσίαζε σύμπλοκα HLA?A2/MP(58?66). Δυο συστήματα Τ κυττάρων προετοιμάστηκαν, μια μεταμολυσμένη με JM22 TCR κυτταρική σειρά και πρωτογενείς Τ κυτταρικοί κλώνοι απομονωμένοι από περιφερικό αίμα. Αυτά τα κύτταρα χαρακτηρίστηκαν για έκφραση TCR και κυτταροτοξικότητα. Ο μακροπρόθεσμος στόχος είναι η μέτρηση παραμέτρων πρόσδεσης σε 2D για την αλληλεπίδραση TCR/pMHC και η συσχέτισή τους με την φυσιολογική απόκριση των κυττάρων στην αναγνώριση αντιγόνου.