Μελέτη του ρόλου των μεταλλαγών στα γονίδια p14ARF, p15INK4b και p16INK4a και της γενωμικής αστάθειας στην ακτινική υπερκεράτωση

Abstract

Actinic keratosis (AK) is a well-established pre-cancerous skin lesion that has the potential to progress to squamous cell carcinoma (SCC). We investigated the involvement of the CDKN2A, CDKN2B and p53 genes in AK and in the progression of AK to SCC. Mutational analysis on exons 1a, 1b and 2 of the CDKN2A locus and exon 1 of the CDKN2B locus as well as allelic imbalance was performed in 26 AK specimens. Expression levels of the genes p14ARF, p15INK4b, p16INK4a and p53 were examined in 16 AKs and 12 SCCs by real-time RT-PCR. A previously-described polymorphism of p16INK4a (Ala148Thr) was detected at an allelic frequency of 12%. Six samples carried novel mutations at codon 71 of the CDKN2A locus and one sample presented an additional mutation at codon 65. Two AK samples carried a notpreviously described non-UV type missense mutation at codon 184 (Val184Glu) of exon 1b in the p14ARF gene. Regarding the CDKN2B locus a new mutation at codon 50 (Ala50Thr) and another at codon 24 (Arg24Arg), were detected. Microsatellite instability (MSI) was found in at 15% of AKs in at least one marker, indicating that genetic instability has some implication in the development of AK. Down-regulation of p16INK4a and p53 mRNA levels was noted in SCC compared to AK. TSGs expression levels in sun-exposed morphologically normal-appearing skin, suggests that abnormal growth stimuli might exist in these tissues as well. Furthermore, we suggest a possible role of p15INK4b, independently from the intracellular pathway mediated by p16INK4a, and of p14ARF in AK development, as well as in the progression of AK to SCC. The deregulation of the expression profiles of the CDKN2A, CDKN2B and p53 genes may, independently of mutations and LOH at 9p21, play a significant role in AK and progression of AK to SCC

Η ακτινική υπερκεράτωση (ΑΚ) αποτελεί μια καθιερωμένη προ-καρκινωματώδη βλάβη του δέρματος που μπορεί να εξαλλαχτεί σε ακανθοκυτταρικό καρκίνο (SCC). Στην παρούσα εργασία, μελετήθηκε η συμμετοχή των γονιδίων CDKN2A, CDKN2B και p53 στην ανάπτυξη της ΑΚ και στην εξέλιξη της σε SCC. Πραγματοποιήθηκε ανάλυση μεταλλάξεων στα εξόνια 1a, 1b και 2 του τόπου CDKN2A και στο εξόνιο 1 του τόπου CDKN2B, καθώς επίσης ανάλυση της αστάθειας της αλληλουχίας μικροδορυφορικού DNA σε 26 δείγματα ΑΚ. Μελετήθηκαν τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων p14ARF, p15INK4b, p16INK4a και p53 σε 16 δείγματα ΑΚ και 12 δείγματα SCC με την μέθοδο της αντίστροφης μεταγραφής – αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (real time RT-PCR). Ένας πολυμορφισμός που έχει ήδη περιγραφεί στο p16INK4a (Ala148Thr) ανιχνεύτηκε σε ένα ποσοστό 12%. Σε έξι δείγματα ΑΚ ανιχνεύτηκαν καινούργιες μεταλλάξεις στο κωδικόνιο 71 του τόπου CDKN2A και ένα δείγμα παρουσίασε μια επιπλέον μετάλλαξη στο κωδικόνιο 65. Δύο δείγματα ΑΚ εμφάνισαν μια μη επαγώμενη από UV μετάλλαξη η οποία δεν έχει αναφερθεί προηγουμένως στο εξόνιο 1b του γονιδίου p14ARF. ΄Οσον αφορά τον τόπο CDKN2B, ανιχνεύτηκαν μια καινούργια μετάλλαξη στο κωδικόνιο 50 (Ala50Thr) και μια άλλη στο κωδικόνιο 24 (Arg24Arg). Μικροδορυφορική αστάθεια ανιχνεύτηκε στο 15% των δειγμάτων της ΑΚ σε έναν δείκτη τουλάχιστον, υποδεικνύοντας ότι η μικροδορυφορική αστάθεια πιθανόν να παίζει κάποιο ρόλο στην ανάπτυξη της ΑΚ. Τα αποτελέσματα μας προτείνουν μείωση της έκφρασης του mRNA των γονιδίων p16INK4a και p53 στο SCC σε σύγκριση με τα αντίστοιχα επίπεδα έκφρασης στην AK. Τα επίπεδα έκφρασης των ογκοκατασταλτικών γονιδίων σε μορφολογικά φυσιολογικούς ιστούς που έχουν εκτεθεί στον ήλιο, προτείνει ότι μη φυσιολογικά ερεθίσματα κυτταρικής ανάπτυξης μπορεί να υπάρχουν επίσης και σε αυτούς τους ιστούς. Επιπλέον, προτείνουμε ένα πιθανό ρόλο για το p15INK4b, ανεξάρτητο από την ενδοκυττάρια οδό μεσολαβούμενη από το p16INK4a και του p14ARF στην ανάπτυξη της ΑΚ, καθώς επίσης στην εξελιχτική πορεία της μετατροπής της AK σε SCC. Εκτός από την παρουσία μεταλλάξεων και γενωμικής αστάθειας (LOH/MSI) στο 9p21, η απορρύθμιση του προφίλ έκφρασης των ογκοκατασταλτικών γονιδίων (TSGs) πιθανόν να παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη της AK και στην μετατροπή της σε SCC