Μελέτη μηχανισμών αντοχής στα αντιβιοτικά στελεχών της stenotrophomonas maltophilia

Abstract

Our study concerned the susceptibility, the molecular typing and the antimicrobial resistance mechanisms of 25 clnical strains of S.maltophilia isolated through one year period from six tertiary care hospitals in Athens. We compared broth microdilution (Sesititre) results, with those from disc diffusion, PASCO broth microdilution and E-test. According to Sensititre and PASCO, the most effective agent was trimethoprim/sulfamethoxazole with 24% and 32% respectively of the isolates being susceptible to this agent. The 25 isolates studied, proved by PFGE to have different patterns. Twelve isolates were totally unrelated (differed by seven or more bands) and 13 isolates were probably related (differed by four up to six bands). Among the 13 isolates probably related, only two had the same susceptibility pattern for all methods and for all antibiotics tested. Antimicrobial resistance mechanisms to beta-lactames was investigated at first by hydrolysis test of S.maltophilia strains. Using spectophometry test, meropenem revealed the largest percentage of hydrolysis, followed by piperacillin, imipenem, piperacillin/tazobactam, cefotaxim, aztreonam and ceftazidime. It is well known that meropenem is a special substrate for L1 beta-lactamase and for others metallo-beta-lactamases of S.maltophilia as well. Ceftazidime is a special substrate for L2 beta-lactamase. We therefore can speculate that the majority of the strains produces L1 or others metallo-beta-lactamases rather than L2 beta-lactamase. Using the microbiological test, hydrolysis of imipenem was found to be at the focal points of L1-beta-lactamase and L2-beta-lactamase. Thus the existence of these beta-lactamases was confirmed. We defined then the isoelectric points of beta-lactamases. Eighteen out of 25 strains.. which hydrolysed imipenem,. produced beta-lactamases with pI?8.2. Eight of these strains produced further beta-lactamases with pI from 5.4 up to 8.2, whereas five produced beta-lactamases with pI from 7.6 up to 8.0. The synergy test of clavulanic/imipenem traced right 13 out of 18 strains which produced L2-beta- lactamase. The isoelectric point of L1 beta-lactamase is supposed to be 6.9. Thus, no strain produced L1 beta-lactamase. Meanwhile others metallo-beta-lactamases with pI from 4.8 up to 6.8 in S.maltophilia strains are concerned in the literature. These strains hydrolysed imipenem and were suspended from EDTA. In our study, EDTA suspended 11 of the 25 strains. Six of the 11 strains produced beta-lactamases from 5.4 up to 7.8. It is possible then that these strains produce others than L1, metallo- beta-lactamases. No genes that encode VIM or TEM beta-lactamase were found in none of the strains tested. Using the Sensititre method, amicacin was the more active from all aminoglycosides since 44% of the strains tested were susceptible, whereas 36% and 28% of the strains were susceptible to tobramycin and gentamycin. The agar dilution method was used to define the resistance phenotype (AGRPs) of the strains. Using a special computer programme which defines the possible resistance mechanisms in aminoglycosides, we found that the possible resistance mechanism of the strains tested in aminoglycosides was reduced permeability. Using the in situ hybridizisation method, no aminoglycoside-modifying enzyme was detected in the strains tested. Six strains with MICs from 4 up to 32 mg/L for ciprofloxacin were tested, in terms of detection of quinolones resistance mechanisms of S.maltophilia. Using PCR, substitution of a Arg to Leu at the position 47 of GyrA and lack of 11 aminoacids was detected in GyrB in all strains tested. No aminoacid change was detected in ParC. In 12 strains with MIC?2 mg/L for ciprofloxacin, MICs in the presence and absence of CCCP in subinhibitory concentrations, were calculated. Important was concerned any change of MIC?2 mg/L in twofold dilutions. With the presence of CCCP, MICs for piperacillin were reduced up to twofold dilutions for 4 strains, whereas MICs for cefipime and ciprofloxacin were reduced up to twofold dilutions for 6 strains. Given the fact that tetracyclines, erythromycin, chloramphenicole, ciprofloxacin, meropenem and maybe piperacillin, cefepime, and azteronam are substrate for efflux pump smeDEF, whereas ciprofloxacin is substrate for efflux pump smeABC, it is possible that 6 of the 12 strains carry one or both efflux pumps. For determination of outer membrane proteins as possible resistance mechanism of quinolones, 10 strains with MIC?2 mg/L for ciprofloxacin and one susceptible, were tested. In electrophoresis of OMPs, overexpression of a protein with MB=50kDa was observed. In the literature this protein is related to the oprM of P.aeruginosa, and it constitutes basic component of the efflux pumps SmeABC and SmeDEF and possibly of a third efflux pump which is not yet being studied. Overexpression of protein wih MB 20 kDa was observed in all strains tested. ...

H ερευνητική μας εργασία αφορούσε τις ευαισθησίες, την επιδημιολογική τυποποίηση και τη διερεύνηση των μηχανισμών αντοχής στα αντιβιοτικά 25 κλινικών στελεχών S.maltophilia που απομονώθηκαν στη διάρκεια ενός έτους από τριτοβάθμια νοσοκομεία της Αθήνας. Για τον προσδιορισμό της ευαισθησίας των στελεχών στα αντιβιοτικά χρησιμοποιήθηκαν οι μικρομέθοδοι αραίωσης σε ζωμό PASCO και Sensititre και οι μέθοδοι διάχυσης, αυτή των δίσκων και το E test. Η μικρομέθοδος αραίωσης σε ζωμό Sensititre χρησιμοποιήθηκε σα μέθοδος αναφοράς και εκτιμήθηκαν οι αποκλίσεις στα αποτελέσματα μεταξύ αυτής και των υπολοίπων μεθόδων. Οι μικρομέθοδοι αραίωσης σε ζωμό έδειξαν το μεγαλύτερο μεταξύ τους συσχετισμό και σύμφωνα με αυτές η τριμεθοπρίμη/σουλφομεθοξαζόλη ήταν το πιο αποτελεσματικό αντιβιοτικό, με 24% από τα στελέχη να είναι ευαίσθητα με την PASCO και 32% με τη Sensititre. Ακολούθησε η επιδημιολογική τυποποίηση των στελεχών με ηλεκτροφόρηση εναλασσόμενου πεδίου (PFGE) κατά την οποία μόνο δύο στελέχη παρουσίασαν πανομοιότυπο ηλεκτροφορητικό πρότυπο τα οποία είχαν απομονωθεί από το ίδιο τμήμα ενός νοσοκομείου. Σύμφωνα με τα κριτήρια του Tenover μοναδικά (με περισσότερες από 7 ζώνες διαφορά) κρίθηκαν 12 στελέχη, ενώ τα υπόλοιπα θεωρήθηκαν πιθανά σχετιζόμενα (διαφορά 4-6 ζώνες). Η διερεύνηση των μηχανισμών αντοχής στις β-λακτάμες έγινε κατ’αρχήν με τον έλεγχο της υδρολυτικής ικανότητας των εξεταζομένων στελεχών.. Χρησιμοποιώντας τη σπεκτοφωτομετρική μέθοδο το μεγαλύτερο ποσοστό υδρόλυσης παρουσίασε η μεροπενέμη με δεύτερη την πιπερακιλλίνη. Ακολούθησαν η ιμιπενέμη, η πιπερακιλλίνη/ταζομπακτάμη, η κεφοταξίμη, η αζτρεονάμη και τελευταία η κεφταζιντίμη. Mε δεδομένο το γεγονός ότι η μεροπενέμη αποτελεί ειδικό υπόστρωμα για την L1 β-λακταμάση ενώ η κεφταζιντίμη αποτελεί ειδικό υπόστρωμα για την L2 β-λακταμάση, μπορούμε να υποθέσουμε ότι η πλειονότητα των στελεχών εκφράζει περισσότερο την L1 από την L2 β-λακταμάση, Με τη μικροβιολογική μέθοδo ανιχνεύθηκε υδρόλυση της ιμιπενέμης στα σημεία εστίασης της L1 και L2 αντίστοιχα, οπότε και επιβεβαιώθηκε η ύπαρξη των παραπάνω λακταμασών. O προσδιορισμός των ισοηλεκτρικών σημείων των β-λακταμασών στα στελέχη που εξετάσθηκαν κατέδειξε την ύπαρξη β-λακταμασών με pI μεγαλύτερο ή ίσο του 8,2 στην πλειονότητά τους (18 από τα 25 στελέχη). Τα στελέχη αυτά υδρόλυαν την ιμιπενέμη. Οκτώ από αυτά τα στελέχη παρήγαγαν και άλλες λακταμάσες με pI από 5.4 έως 8.2, ενώ πέντε παρήγαγαν λακταμάσες με pI από 7.6 έως 8.0. Ο έλεγχος πιθανής συνέργειας μεταξύ κλαβουλανικού και ιμιπενέμης ανίχνευσε σωστά 13 από τα 18 στελέχη που έφεραν την L2 λακταμάση. Βάσει του ισοηλεκτρικού σημείου που αναφέρεται στη βιβλιογραφία για την L1-β- λακταμάση (6.9) κανένα από τα στελέχη που εξετάσθηκαν δεν έφερε L1-β-λακταμάση. Ωστόσο μεταλλο-β-λακταμάσες με pI από 4.8 έως 6.8 έχουν αναφερθεί σε στελέχη S.maltophilia. Tα στελέχη αυτά υδρόλυαν τις πενέμες (ιμιπενέμη, μεροπενέμη), και αναστέλλονταν από το EDTA. Στην μελέτη μας το EDTA ανέστειλε 11 από τα 25 στελέχη. Έξι από τα 11 στελέχη έφεραν λακταμάσες με pI από 5.4 έως 7.8. Eίναι λοιπόν πιθανόν τα στελέχη αυτά να φέρουν άλλες εκτός της L1 μεταλλο-β-λακταμάσες, γεγονός που υποστηρίζεται και από τα αποτελέσματα της υδρόλυσης.. Δεν ανιχνεύθηκαν τα γονίδια που κωδικοποοιούν τις λακταμάσες VIM και TEM σε κανένα από τα στελέχη. Από τις αμινογλυκοσίδες και λαμβάνοντας σα μέθοδο αναφοράς τη Sesititre, η αμικασίνη φαίνεται η πιο δραστική από όλες αναστέλλοντας το 44% των στελεχών και ακολουθούν η τομπραμυκίνη και η γενταμυκίνη (36% και 28% των στελεχών ευαίσθητα αντίστοιχα). Χρησιμοποιήσαμε τη μέθοδο διάχυσης σε άγαρ προκειμένου να προσδιορίσουμε το φαινότυπο αντοχής (AGRPs) των εξεταζομένων στελεχών.και στη συνέχεια χρησιμοποιώντας ειδικό πρόγραμμα στον ηλεκτρονικό υπολογιστή (Schering-Plough, Bloomfield, New Jersey, USA) που υπολογίζει βάσει των διαμέτρων των ζωνών αναστολής και συγκεκριμένων βιβλιογραφικών δεδομένων,τους πιθανούς μηχανισμούς αντοχής (μειωμένη διαπερατότητα, ύπαρξη αμινογλυκοσιδοτροποποιητικών ενζύμων) καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι η πλειονότητα των στελεχών που εξετάσθηκαν (23 στα 25) παρουσίαζε ελαττωμένη διαπερατότητα. Επιπλέον με τη μέθοδο του in situ υβριδισμού δεν ανιχνεύθηκε σε κανένα στέλεχος S.maltophilia αμινογλυκοσιδοτροποποιητικό ένζυμο των ομάδων: AAC (6)-I (aac (6)-Ib, aac(6)-1c), AAC (3) (aac(3)-Ia, aac(3)-Va), ANT (2) (ant (2’’)-Ia) και APΗ (3) (aph (3’)-Ia, aph (3’)-Via). ...